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Synthese und Charakterisierung von ternären Halogeniden und Oxidhalogeniden der Übergangsmetalle
(2003)
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Sabina Hartwig
- Hauptziel dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung neuer Enneahalogenodimetallate der Übergangsmetalle Titan, Vanadium und Chrom. Mit Hilfe der so erhaltenen Daten war es möglich, Untersuchungen an Systemen mit repulsiven Metall-Metall-Wechselwirkungen durchzuführen und diese mit Systemen mit attraktiven Wechselwirkungen zu vergleichen. Dabei konnten mit Cs3Ti2I9, Cs3V2I9 und Rb3Cr2I9 drei neue A3M2X9-Verbindungen in einkristalliner Form dargestellt und mittels Röntgen-strukturanalyse charakterisiert werden. Darüber hinaus gelang es erstmals, von acht weiteren A3M2X9-Verbindungen mit A = K, Rb, Cs, M = Ti, V, Cr und X = Cl, Br, I für die Röntgenstrukturanalyse geeignete Einkristalle zu züchten. Damit konnte der zur Verfügung stehende Datensatz exakter struktureller Parameter im Bereich der Systeme mit repulsiven Metall-Metall-Wechselwirkungen an wichtigen Stellen ergänzt werden. Mit Hilfe dieser Daten wurden, Tendenzen und Gesetzmäßigkeiten bezüglich der Geometrie der Doppeloktaedereinheit innerhalb der Gruppen mit bindenden bzw. nichtbindenden Metall-Metall-Wechselwirkungen herausgearbeitet. Im zweiten Schritt wurden diese miteinander verglichen und prinzipielle bzw. graduelle Unterschiede aufgezeigt. Zunächst konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der geometrischen Parameter des M2X9-Doppeloktaeders Systeme mit bindenden und nichtbindenden Metall-Metall-Wechselwirkungen qualitativ unterschieden werden können. Dazu eignen sich in erster Linie der Winkel beta (M-Xb-M) und der Wert für d´/d´´, während die Aussagekraft des Winkels alpha aufgrund der nur sehr geringen Unterschiede zwischen bindenden und nichtbindenden Verbindungen gering bleibt. Der Nachteil bei Verwendung dieser Parameter besteht allerdings darin, dass sie eine Abhängigkeit von der die Übergangsmetallatome umgebenden Matrix zeigen. Mit der Einführung der Parameter k1 (Verhältnis des mittleren M-X-Abstandes zum M-M-Abstand), k2 (Verhältnis M-Xt / M-Xb), k3 (Verhältnis Xb-Xb / Xt-Xt) und k4 (Verhältnis Höhe des Doppeloktaeders zum mittleren X-X-Abstand) wurden, die Metall-Metall-Wechselwirkungen halogen- bzw. alkalimetallunabhängig betrachtet. Quantitative Aussagen lässt allerdings nur k3 zu, mit dem zumindest in bindenden Systemen, die Stärke der Metall-Metall-Wechselwirkung abgeschätzt werden kann, während die k3-Werte bei den nichtbindenden Enneahalogenodimetallaten sehr eng zusammen liegen und eine Quantifizierung nicht sinnvoll ist. Die Parameter k1, k2 und k4 liefern „halbquantitative“ Trends, die eine Unterscheidung bindend / nichtbindend ermöglichen. Insgesamt zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass quantitative Aussagen über die Stärke von Metall-Metall-Bindungen allein anhand dieser geometrischen Betrachtungsweise nur sehr bedingt möglich sind, während eine qualitative Unterscheidung sehr zuverlässig ist. Zur weiteren Charakterisierung der synthetisierten Enneahalogenodimetallate wurden zunächst phasenreine Proben dargestellt und IR-, Raman- sowie UV-Vis-spektroskopisch untersucht. Die erhaltenen Spektren wurden durch Vergleich mit der Literatur bzw. anhand von theoretischen Berechnungen ausgewertet und den IR- bzw. Raman-Banden die entsprechenden Schwingungen sowie den UV-Vis-Banden die zugehörigen elektronischen Absorptionen zugeordnet werden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Synthese und Charakterisierung von Übergangsmetalloxidhalogeniden. Dabei wurden mit NbO2I und NbOI3 zwei neue ternäre und mit KWOI4 bzw. RbWOI4 zwei neue quarternäre Verbindungen in einkristalliner Form dargestellt und röntgenographisch charakterisiert. NbO2I kristallisiert in einem völlig neuen Strukturtyp. Dieser lässt sich nahtlos in die Struktursystematik der Oxidhalogenide einreihen. Dabei liegen Schichten vor, in denen Oktaeder über Spitzen zu Ketten und diese über Kanten zu Schichten verknüpft sind. Jeweils zwei dieser Schichten sind wiederum um eine halbe Kantenlänge gegeneinander verschoben und bilden so isolierte Doppelschichten, in denen eine Kante jedes Oktaeders durch ein Sauerstoffatom der Nachbarschicht überkappt ist Das Niob besitzt dabei die ungewöhnliche Koordinationszahl sieben. Im neuen Strukturtyp des NbOI3 stellen, wie auch im NbOCl3-Typ, Doppelstränge aus über Sauerstoffatomen verknüpften Nb2O4I6-Doppeloktaedern das strukturbestimmende Motiv dar. Die Doppelstränge liegen im NbOI3 jedoch parallel nebeneinander, während sie im NbOCl3 abwechselnd um 90° gegeneinander verdreht sind. Die Struktur der beiden isotypen quarternären Oxidiodide KWOI4 und RbWOI4 kann als eine Verzerrungs- und Auffüllungsvariante des WOCl4-Typs angesehen werden, bei der in den Ketten aus spitzenverknüpften WO2I4-Oktaedern jeweils aufeinanderfolgende Oktaeder um 45° gegeneinander verdreht sind. Die Alkalimetalle sitzen in Lücken zwischen den Ketten.
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In vitro-Evolution und Analyse der biophysikalischen Grundlagen der Proteinstabilität
(2003)
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Andreas Martin
- In der vorliegenden Arbeit wurde Proside, ein Selektionssystem für stabilisierte Proteine, weiterentwickelt und dafür genutzt, die molekularen Ursachen erhöhter Proteinstabilität zu analysieren. Für diese in vitro-Evolutionsexperimente diente das Kälteschockprotein Bs-CspB aus Bacillus subtilis als Modellprotein. Zusätzlich wurde das Gen-3-Protein (G3P) des Phagen fd, eine essentielle Komponente von Proside, thermodynamisch charakterisiert und sein Faltungsmechanismus aufgeklärt. Proside basiert auf phage display und verknüpft die thermodynamische Stabilität eines Proteins mit einem sehr gut selektierbaren Parameter, der Infektiosität filamentöser Phagen. Die Größe der selektierbaren Mutantenbibliotheken konnte durch Veränderungen des Phagenkonstrukts und der zu ihrer Erstellung verwendeten molekularbiologischen Methoden auf mehr als 108 Varianten gesteigert werden. Gleichzeitig wurde mit diesen Modifikationen der rekombinationsbedingte Verlust von Gastproteinsequenzen aus dem Phagengenom deutlich reduziert. Das Gen-3-Protein, in welches diese Gastproteine inseriert werden, wurde mittels Proside um mehr als 10 kJ/mol stabilisiert. Somit sind jetzt in vitro-Selektionen bei Temperaturen von bis zu 60 °C möglich, ohne dass die Stabilität der Phagenproteine selbst limitierend für die Optimierung der Gastproteine wirkt. Das Potential der so optimierten Proside-Methode konnte anhand der Selektionen stark stabilisierter Varianten von Bs-Csp gezeigt werden. Dieses Protein unterscheidet sich von seinem um 15,8 kJ/mol stabileren Homologen Bc-Csp aus dem thermophilen Bacillus caldolyticus in 12 von 67 Resten, die alle an der Oberfläche des Proteins liegen. Die in vitro-Selektionen nach Sättigungsmutagenese an sechs dieser zwölf Positionen in Bs-CspB lieferten eine Vielzahl von stabilisierten Mutanten, die, abhängig von den Selektionsbedingungen, unterschiedliche Stabilisierungsprinzipien aufzeigten. Während bei der Selektion in Gegenwart des ionischen Denaturierungsmittels GdmCl vor allem die hydrophoben Wechselwirkungen verbessert wurden, führte die Selektion bei erhöhter Temperatur zusätzlich zur Optimierung der Coulomb´schen Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche. Für die stabilste der selektierten Varianten von Bs-CspB ist der Mittelpunkt des thermischen Entfaltungsübergangs um mehr als 28 Grad relativ zum Wildtypprotein angehoben und liegt damit auch deutlich höher als der Wert des thermostabilen Referenzproteins Bc-Csp. Die Variante unterscheidet sich von Bc-Csp an allen sechs randomisierten Positionen. Dennoch nutzen die beiden Proteine ähnliche Strategien für eine hohe Thermostabilität, insbesondere zeichnen sie sich durch eine im Vergleich zu Bs-CspB optimierte Verteilung der Oberflächenladungen aus. Ladungsnetzwerke auf der Proteinoberfläche sind für die Thermostabilität der Kälteschockproteine sehr wichtig. Basierend auf diesen Erkenntnissen war es möglich, ein hyperstabiles Kälteschockprotein mit lediglich vier Austauschen relativ zu Bs-CspB zu konstruieren. Der Schmelzpunkt dieser Variante liegt bei 85,6 °C, d.h. 31,6 Grad über dem des Wildtypproteins. Sie ist damit sogar stabiler als das homologe Csp aus dem hyperthermophilen Organismus Thermotoga maritima. Die Stabilitätsuntersuchungen des für die Phageninfektion essentiellen N-terminalen Fragments des Gen-3-Proteins reflektieren dessen Aufbau aus den beiden Domänen N1 und N2. Während die Stabilität der Domäne N1 unabhängig von Domäne N2 ist, wird Domäne N2 wesentlich durch die Interdomänenwechselwirkungen mit N1 stabilisiert, und ihre Entfaltung ist mit der Domänendissoziation gekoppelt. Die vier mittels Proside gefundenen Mutationen in G3P stabilisieren beide Domänen unabhängig voneinander und verdeutlichen die generellen Prinzipien, die der Stabilität von Zweidomänenproteinen zugrunde liegen. Neben der Erhöhung der intrinsischen Stabilitäten der individuellen Domänen spielt die Verbesserung der Domäneninteraktionen eine entscheidende Rolle für die Stabilisierung des gesamten Proteins. Die Rückfaltung von G3P ist ein sequentieller Prozess. Domäne N1 faltet innerhalb weniger Millisekunden, gefolgt von der Faltung der N2-Domäne, die nach etwa 3 min abgeschlossen ist. Im letzten Schritt assoziieren die beiden Domänen in einer extrem langsamen Reaktion. Sie zeigt eine Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) und ist in ihrer Rate limitiert durch die trans-cis-Isomerisierung an Pro213 in der Gelenksubdomäne von N2. Durch die Assoziation von N1 und N2 werden beide Domänen in ihrer Entfaltung gekoppelt, so dass Domäne N1 bis zu 150.000-fach langsamer entfaltet als in isolierter Form. Die Prolin-limitierte sehr langsame Domänenassoziation ist möglicherweise für die Funktion des G3P bei der Infektion von E. coli von Bedeutung. Sie erlaubt es, die Domänen nach Bindung an den F-Pilus so lange dissoziiert zu halten, bis der Pilus zurückgezogen ist und Domäne N1 mit dem Corezeptor TolA an der Zelloberfläche wechselwirken kann.
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Städtetourismus in Regensburg. Images, Motive und Verhaltensweisen von Altstadttouristen
(2003)
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Bert Bödeker
- In den letzten Jahrzehnten verzeichnete der Städtetourismus einen großen Bedeutungsanstieg. Trotzdem liegen nur wenige systematische Studien vor, die zu einem besseren Verständnis städtetouristischer Aspekte beitragen. Die vorliegende Arbeit sollte ein Baustein zur Reduzierung dieser Defizite sein und der Fragestellung nachgehen, welche Angebotsfaktoren, Images und Motive im Städtetourismus existieren, welche Rolle Destinationsmarketing und Reisemedien dabei spielen und wie sich dies im Verhalten der Touristen äußert. Die Wahl des Fallbeispiels fiel auf Regensburg, da die Stadt zu den großen Gewinnern des Städtereise-Booms und den wichtigsten Reisezielen in Bayern gehört. Die empirische Basis dieser Studie beruht auf einer Verknüpfung verschiedenster qualitativer und quantitativer Methoden. Als Rahmen der Erhebungen wurden Statistiken herangezogen, Expertengespräche geführt und Prospekte auf der Internationalen Tourismus Börse ausgewertet. Der Hauptteil der Empirie bestand aus Touristenbefragungen, verfolgenden Beobachtungen (Trackings) und der Inhaltsanalyse von Reisemedien, ergänzt durch eine Kartierung, Passantenzählungen, Busfahrerbefragungen und teilnehmende Beobachtungen bei Stadtführungen. Die Zusammenführung der Einzelergebnisse ergab, dass sich die Touristen auf einen räumlich engen Bereich der Altstadt konzentrieren, der zugleich die größte Dichte an saniertem historischem Baubestand, historischen Sehenswürdigkeiten und Einrichtungen des Einzelhandels sowie der Gastronomie bietet. Diese touristische Altstadt ist über viel benutzte Korridore mit mehreren Großparkplätzen verbunden und wird durch einen kleinen, direkt anschließenden Teil des Haupteinkaufsbereichs ergänzt, der ebenfalls häufig von Touristen frequentiert ist, obwohl er einen geringen historischen Baubestand aufweist. Die Touristen in der Regensburger Altstadt haben kein tieferes Interesse an den kulturhistorischen Sehenswürdigkeiten, sondern suchen überwiegend ein kulturangeregtes Erlebnis, bei dem die Gebäude als ästhetische Kulisse für einen Stadtbummel dienen. Wichtige Elemente dieses Stadtbummels sind die Schaufenster und Geschäfte. Touristen unterscheiden sich beim Bummeln nicht grundlegend von den Einheimischen, sie geben aber kaum Geld im Einzelhandel aus. Im Gegensatz dazu wird beim Besuch gastronomischer Einrichtungen, der fast grundsätzlich zu einem touristischen Aufenthalt in Regensburg gehört, nicht so sehr auf den Geldbeutel geschaut und oft viel Zeit verwendet. Die Touristen in der Regensburger Altstadt zeigen große Verhaltensähnlichkeiten, z.B. bei der Routenwahl. Zugleich lassen sich innerhalb der relativ begrenzten Reiseart des Altstadttourismus aber verschiedene Reisestile unterscheiden. Etwa der Hälfte der Touristen geht es bei dem Besuch hauptsächlich um die Besichtigung. Die andere Hälfte der Touristen will ebenfalls die Altstadt und ihre Sehenswürdigkeiten besichtigen, zeigt aber ein großes Interesse an der Verknüpfung der Besichtigung mit der Nutzung anderer städtischer Angebotsformen wie dem Einzelhandel. Das Bild, das die Regensburg-Touristen von der Stadt haben, ist sehr eng eingebettet in das allgemeine Fremdimage. Trotz der Verwendung desselben Stereotyps sind die Assoziationen der Regensburg-Touristen aber deutlich detaillierter. Die Assoziationen wandeln sich außerdem mit der Anzahl der Aufenthalte in Regensburg weiter und werden durch neue ergänzt. Der grundsätzliche Stereotyp wird dadurch jedoch kaum beeinflusst und erst nach mehrmaligen Aufenthalten nimmt der Anteil individueller Assoziationen, die den öffentlichen Stereotyp ergänzen, merklich zu. Die Nutzung von Informationsmaterialien wie Reiseführer oder Prospekte wiederum beeinflusst die Assoziationen nicht in einem nennenswerten Umfang. Bei der Ermittlung des Images über Rating-Skalen zu vorgegebenen Aussagen über die Stadt zeigt sich noch sehr viel mehr als bei den Assoziationen eine erstaunlich hohe Stabilität der Antworten. Ein Besuch in Regensburg verändert die Einschätzungen nur dahingehend, dass sie mit größerer Sicherheit zum Ausdruck gebracht werden können. Diese Stabilität der zentralen Stereotype bewirkt, dass Touristen am Reiseziel weitgehend das Bild von Regensburg haben, das sie bereits hatten, bevor sie über eine Reise nach Regensburg nachdachten. Auf der Basis der empirischen Ergebnisse wurden verschiedene Aussagen zum Altstadttourismus in Regensburg und Empfehlung für Marketing und Planung formuliert. Die Integration der bislang in der Tourismusforschung kaum angewandten Trackingmethode in die Untersuchung ermöglichte einerseits eine Überprüfung von Befragungs- und Kartierungsergebnissen und erbrachte andererseits zahlreiche Erkenntnisse zum Verhalten von Städtetouristen. Die Trackings erwiesen sich als enorm aufwendige, aber sehr ergiebige Erhebungsmethode, von deren Ausbau wichtige Grundlagenerkenntnisse zum Verhalten von Touristen zu erwarten sind.
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Die Funktion von Three rows bei der Schwesterchromatiden-Trennung in Drosophila melanogaster
(2003)
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Alf Herzig
- In der Mitose werden die Schwesterchromatiden getrennt und auf beide Tochterzellen verteilt. Die Trennung der Schwesterchromatiden erfordert die proteolytische Spaltung des Scc1-Proteins. Scc1 ist Bestandteil des Kohäsin-Komplexes, der die Schwesterchromatiden nach ihrer Entstehung in der S-Phase bis zum Beginn der Anaphase gepaart hält. Die Protease, die durch Scc1-Spaltung die Schwesterchromatiden-Trennung einleitet, heißt Separase. Die Separase wird erst dann aktiviert, wenn alle Chromosomen bipolar mit dem mitotischen Spindelapparat verbunden sind. Die Aktivierung der Separase erfordert die Ubiquitinabhängige Degradation des Securins, einer inhibitorischen Untereinheit der Separase. Weitere Mechanismen der Separase-Regulation sind noch nicht vollständig verstanden. Das Securin von Drosophila melanogaster ist das Protein Pimples (PIM). Die Separase (SSE) von D. melanogaster besitzt zwar eine Protease-Domäne, aber die N-terminale regulatorische Domäne, die in Separasen anderer Eukaryoten gefunden wird, fehlt in SSE fast vollständig. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PIM und SSE einen heterotrimeren Komplex mit dem Protein Three rows (THR) bilden. THR besitzt Bindungsstellen für PIM und SSE. In anderen Organismen besitzt die N-terminale Separase-Domäne Bindungsstellen für das Securin und die Protease-Domäne der Separase. Diese Ergebnisse legen nahe, dass THR strukturell der N-terminalen Domäne anderer Separasen entspricht. Die Separase aus D. melanogaster scheint demnach aus zwei Untereinheiten aufgebaut zu sein. Während SSE die katalytische Domäne der Separase beinhaltet, wurde hier gezeigt, dass THR eine regulatorische Separase-Untereinheit ist. THR wird nach dem Metaphasen-Anaphasen-Übergang proteolytisch gespalten. Diese Spaltung erfolgt nur in funktionellen Separase-Komplexen, und die Spaltstelle in THR entspricht dem Konsensus einer Separase-Spaltstelle. Mutationen in dieser Spaltstelle unterbinden die THR-Spaltung. Diese Daten legen nahe, dass THR durch die katalytische Untereinheit der Separase gespalten wird. Die Expression von nicht spaltbaren THR-Varianten führt zu frühembryonaler Letalität bei erniedrigter Temperatur. Diese Letalität wird unterdrückt, wenn die katalytische Aktivität der Separase erniedrigt wird. Die Spaltung von THR trägt demnach zur Inaktivierung der Separase bei. Die Spaltung von THR ist vor allem während der Zellularisierung wichtig, einem insektenspezifischen Prozess in der Embryonalentwicklung von D. melanogaster. Während der Zellularisierung führt die ausbleibende Inaktivierung der Separase zu Defekten im Tubulin-Zytoskelett. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Separase in D. melanogaster weitere Substrate neben den Kohäsinen und andere Funktionen als in der Schwesterchromatiden-Trennung hat.
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Bedeutung der Verpaarungsqualität für Verhalten und Gesundheit von Spitzhörnchen (Tupaia belangeri)
(2003)
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Frank Uhl
- Ziel dieser Arbeit war es, Ursachen verschiedener Verpaarungsqualitäten bei Spitzhörnchen und deren Auswirkung auf verschiedene physiologische Parameter zu erfassen. Dazu wurden die Fragestellungen dieser Arbeit in zwei unterschiedlichen Versuchsansätzen bearbeitet. Im ersten wurden Weibchen entweder mit einem harmonischen oder unharmonischen Partner im Versuch eingesetzt, im zweiten wurden die Weibchen je einmal mit einem harmonischen und einem unharmonischen Partner verpaart. Der Versuch bestand aus einer sechswöchigen Verpaarungsphase mit abschließender Trennung der Tiere. Während des Versuchs wurde das Verhalten der Tiere aufgezeichnet und mehrfach Blutproben entnommen. Es konnte gezeigt werden, dass die unharmonische Verpaarung eine Konsequenz aus der Ablehnung des Männchens durch das Weibchen als Sexualpartner ist. Dabei ist die „Sympathie“ oder „Antipathie“ für bestimmte Männchen individuell unterschiedlich und vermutlich genetisch determiniert. Die physiologischen Konsequenzen einer harmonischen bzw. einer unharmonischen Verpaarung waren gegenläufig. So stieg bei harmonisch verpaarten Tieren, Männchen wie Weibchen, die Immunkompetenz an und die Stresshormonkonzentrationen im Serum sanken. Bei unharmonisch verpaarten Tieren verhielt es sich umgekehrt. Die verschiedenen Verpaarungsqualitäten manifestierten sich auch im Verhalten der Tiere. Die Weibchen in unharmonischen Paaren waren unruhig; es kam häufig zu Streit zwischen den Tieren. In harmonischen Paaren waren die Weibchen ruhiger und suchten die Nähe des Partners, es bestand eine enge soziale Bindung zwischen Männchen und Weibchen. Diese enge soziale Bindung führte zu den typischen Effekten von social support. Trennte man die Paare, so gingen die physiologischen Werte von Tieren aus unharmonischen Paaren auf ihre Ausgangswerte zurück. Bei den zuvor harmonisch verpaarten Weibchen jedoch sank die Immunkompetenz unter das Niveau der Ausgangswerte ab, während die Stresshormonkonzentration gegenüber den Ausgangswerten erhöht war. Nach 6 Wochen hatte der größte Teil der Tiere die Ausgangswerte wieder erreicht. Ein Teil der Weibchen begann jedoch sich nach der Trennung selbst zu verstümmeln. Bei diesen Tieren war noch sechs Wochen nach der Trennung, die Immunkompetenz verringert und die Stresshormon-konzentrationen erhöht.
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Untersuchungen zur Funktion der Protein-Tyrosin-Phosphatase PTPRR
(2003)
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Jan Eickhoff
- Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Funktion der PTPRR in der zellulären Signaltransduktion mit den Schwerpunkten Substrate, Regulation und Beteiligung an biologischen Prozessen. Von besonderem Interesse war die Rolle der PTPRR bei der Tumorentstehung und Transformation von Zellen. Dabei wurden noch unveröffentlichte Daten bestätigt, daß PTPRR die MAPKn ERK1 und 2 über ein neuartiges MAPK-Bindungsmotiv, das KIM, sowohl in vitro als auch in vivo binden und dephosphorylieren kann. Somit ist PTPRR die erste tyrosinspezifische Phosphatase, der eine Dephosphorylierung von MAPKn in höheren Eukaryonten nachgewiesen wurde. Eine weitere Analyse durch transiente Überexpression der PTPRR in HEK293-Zellen ergab, daß PTPRR spezifisch die MAPKn ERK1/2, nicht jedoch p38 Kinase oder JNK/SAPK dephosphoryliert. Zudem wurde über Transkriptionsaktivierungs-experimente der Nachweis erbracht, daß PTPRR die ERK1/2-vermittelte Aktivierung von Transkriptionsfaktoren negativ beeinflussen kann. Bei der näheren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK1/2 wurde eine vorher unbekannte Verknüpfung des PKA mit dem ERK-Signalweg aufgedeckt. Es wurde gezeigt, daß PKA den im KIM gelegenen Serinrest in der Position 321 der Aminosäuresequenz der PTPRR phosphorylieren und so die Bindung und Dephosphorylierung der ERK1/2 in vivo inhibieren kann. Dies weist auf einen neuartigen Mechanismus hin, über den PKA die Aktivierung des MAPK-Signalwegs reguliert. Ein weiterer Effekt, der nachgewiesen wurde, ist die Inhibition der c-Src-induzierten Phosphorylierung des KIF1C, welcher am retrograden Transport vom Golgi-Apparat zum Endoplasmatischen Retikulium beteiligt ist. Damit wurde PTPRR als erste PTPase mit einer Dephosphorylierung des KIF1C in Verbindung gebracht. Über in vitro-Assoziation mit GST-PTPRR im präparativen Maßstab mit anschließender Sequenzierung der gebundenen Proteine wurden die Hitzeschockproteine HSP70 und GRP78 als in vitro Bindungspartner der PTPRR identifiziert. Die nähere Untersuchung der Bindung ergab, daß diese innerhalb der Juxtamenbrandomäne der PTPRR erfolgt und von ATP abhängig ist. Diese Art der Bindung ist ein Anzeichen dafür, daß die Wechselwirkung spezifisch und PTPRR ein Substrat der Chaperone HSP70 und GRP78 ist, welche für die korrekte Faltung von Proteinen sorgen. Da HSP70 ebenfalls mit anderen Mitgliedern des ERK-Signalwegs wechselwirken kann und zudem aus Komplexen mit den MAPK-Kaskade-Gerüstproteinen KSR und HSP90 isoliert wurde, ergibt sich aus der Assoziation von PTPRR und HSP70 die Möglichkeit einer Beteiligung an einem Multiprotein-ERK-Signalkomplex. Bei der Analyse der endogenen Proteinexpression der PTPRR wurde erstmals das Auftreten verschiedener Isoformen in humanen Zellen nachgewiesen. Über Immunfluoreszenz wurde gezeigt, daß die zytoplasmatische Isoform PTPRRcyto im gesamten Zytoplasma vorkommt, während die Isoform PTPRR TM in perinukleären Vesikeln lokalisiert ist. Ein Vergleich der Effekte verschiedener überexprimierter Isoformen zeigte Unterschiede sowohl bei der PDGF-induzierten Phosphorylierung der ERK1/2 als auch bei der c-Src-vermittelten Phosphorylierung des KIF1C. Zudem wurden in Transkriptionsaktivierungsexperimenten Unterschiede in der ERK1/2-vermittelten Aktivierung von Transkriptionsfaktoren detektiert. In allen Fällen hatte die zytoplasmatische Isoform die stärkste inhibitorische Wirkung. Ferner wurde in stabil mit PTPRR transfizierten NIH3T3-Zellen der Effekt dieser PTPase auf biologische Prozesse untersucht. Dabei wurde ein negativer Einfluß der Überexpression der PTPRR auf die basale und PDGF-induzierte Proliferation sowie auf die Migration der Zellen beobachtet, welche beide an der Tumorentstehung beteiligt sein können. Die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK für diese Effekte wurde dadurch belegt, daß eine Mutante der PTPRR, die ERK1/2 nicht mehr bindet, in beiden Experimenten keine Wirkung zeigte. Außerdem konnte die Überexpression der PTPRR sowie der verwandten PTPase STEP die durch die Onkogene v-Ki-Ras- und Her2-, nicht jedoch die durch v-ErbB- oder v-Fms-induzierte Transformation von NIH3T3-Zellen in Focusbildungs-experimenten verhindern. Zudem reduzierte die Überexpression der PTPRR die Her2-vermittelte Proliferation von Zellen unter Entzug von Wachstumsfaktoren. Diese Daten liefern nicht nur Hinweise auf eine potentiell tumorsupprimierende Wirkung der PTPRR und STEP, sondern gewähren auch Einblicke in die von den Onkogenen ausgehenden Signalwege, die zur Transformation von Zellen führen. Auch wurde nachgewiesen, daß der Expressionslevel der PTPRR in Tumorzellinien und –geweben im Vergleich zu nichttransformierten Zellinien und Geweben erhöht ist. Es ergeben sich erste Hinweise auf einen Rückkopplungsmechanismus, mit dem Zellen versuchen könnten, die durch Onkogene häufig hyperaktivierten ERKn negativ zu regulieren.
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Novel Precursors for Polymer-Protein-Conjugate Synthesis via Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization
(2003)
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Christine Maria Schilli
- The RAFT polymerization of N-isopropylacrylamide with two different chain transfer agents, namely benzyl 1-pyrrolecarbodithioate and cumyl 1-pyrrolecarbodithioate, yielded polymers with narrow molecular weight distributions as well as Mn values that were in good agreement with the calculated ones. A comparison between the Mn values determined from gel permeation chromatography, GPC, and the values from MALDI-TOF mass spectrometry showed that the molecular weights obtained from GPC using polystyrene standards were considerably higher. A relation between log Mn,MALDI and log Mn,GPC was established, which permitted construction of a calibration curve for PNIPAAm polymers. In-situ Fourier-transform near-infrared spectroscopy was applied for the reliable determination of monomer conversions and it indicated living characteristics. Both polymerization processes showed an induction period that seems to be correlated with a retardation in rate, where the induction time is higher for the cumyl chain transfer agent as compared to the benzyl chain transfer agent of the same concentration. The induction periods decrease with decreasing transfer agent concentration and were explained in terms of the different stabilities of the respective radicals that add to monomer in the reinitiation step. The more stable cumyl radical adds slower than the benzyl radical. Both UV spectroscopy and MALDI-TOF mass spectrometry confirm the presence of the expected dithiocarbamate endgroups. MALDI-TOF characterization of the polymer samples showed the transfer agent endgroups together with some initiator-derived polymers. Endgroups that seemed to originate from disproportionation or transfer were the result of fragmentation under MALDI conditions as was shown by a post source decay analysis and MALDI-TOF characterization of the hydrolyzed polymer. With amine-reactive diacetone acrylamide, 2-vinyl-4,4-dimethyl-5-oxazolone and N-hydroxysuccinimide methacrylate, new monomers were polymerized via RAFT in a controlled manner. Poly(diacetone acrylamide) and poly(2-vinyl-4,4-dimethyl-5-oxazolone) showed low polydispersities and good control over molecular weight, where poly(N-hydroxysuccinimide methacrylate) displayed relatively high polydispersities despite the controlled polymerization evident from the monomodal GPC traces. These amine-reactive polymers were subsequently used for successful conjugation to the primary amino group of the model peptide glycine-leucine. For poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(acrylic acid), PNIPAAm-b-PAA, it was demonstrated that hydrogen bonding between N-isopropylacrylamide and acrylic acid units influences strongly its behavior in both the solid state and in solution. The block copolymers form micelles in aqueous solutions in dependence of pH and temperature. Cloud point measurements indicated the formation of larger aggregates at pH 4.5 and temperatures above LCST, whereas micelles formed at pH 5-7 and temperatures above LCST. At pH 5.6 and 50 °C, only micelles were found, whereas, at lower temperatures, larger aggregates and micelles coexist. Formation of larger aggregates by hydrogen bonding interactions was revealed by IR and Raman spectroscopy as well as by cryogenic transmission electron microscopy and dynamic light scattering. Differential scanning calorimetry yielded glass transition temperatures of PNIPAAm-b-PAA that were well above the transition temperatures of the homopolymers, demonstrating molecular interactions between the acrylic acid and the N-isopropylacrylamide blocks. Conjugation of sulfhydryl-terminated PNIPAAm to thiol disulfide exchange reagents and maleimides was probed for later conjugation to proteins. Evaluation of the different cross-linking systems resulted in the choice of maleimides as cross-linkers for subsequent conjugation to the protein streptavidin. Sulfhydryl-terminated PNIPAAm-b-PAA was conjugated to the streptavidin mutant S139C using a bismaleimide cross-linker and also direct conjugation via disulfide linkage. Both conjugations were successful and proceeded with more than 50 % conversion. Conjugation of PNIPAAm and PNIPAAm-b-PAA was also achieved by non-covalent attachment of the biotinylated polymers to wild-type streptavidin. Conjugates of wild-type streptavidin with biotinylated PNIPAAm-b-PAA were found to remain dissolved at temperatures above LCST even at very low pH values, which was in contrast to the observed precipitation of the unconjugated block copolymer at pH <= 4.5. Conjugates of wild-type streptavidin with biotinylated PNIPAAm of different molecular weights formed aggregates in aqueous solutions above LCST and a dependence of aggregate size on the size of the polymer was found
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Synthese und Charakterisierung neuer Pentamethylcyclopentadienyl-Halbsandwichkomplexe des Tantals mit N-haltigen Liganden
(2003)
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Achim Goller
- Halbsandwichkomplexe mit Metallen der 5. Gruppe des Periodensystems (M = V, Nb, Ta) sind in großer Anzahl bekannt. Die meisten in der Literatur beschriebenen Verbindungen sind Vanadiumkomplexe, es gibt wesentlich weniger Niobkomplexe und am kleinsten ist die Anzahl der Tantalverbindungen. Ziel der vorliegenden Dissertation war es, ausgehend von Cp*TaCl4 (1) neue Pentamethylcyclopentadienyl-Halbsandwichkomplexe des Tantals zu synthetisieren und zu charakterisieren. Halbsandwich-Azidokomplexe Zur Darstellung neuer Halbsandwich-Azidokomplexe des Tantals wurde Cp*TaCl4 (1) mit Trimethylsilylazid, Me3SiN3, zur Reaktion gebracht. Dazu wurde 1 mit einem zunehmenden Überschuss an Trimethylsilylazid umgesetzt, um einen sukzessiven Austausch der Chloroliganden gegen Azidoliganden zu erreichen. Unter milden Bedingungen, d. h. bei der Reaktion von 1 mit einer stöchiometrischen Menge an Trimethylsilylazid entstand zunächst der zweikernige Komplex Pentametylcyclopentadienyl-Monoazido-Trichloro-Tantal-Dimer (18). Durch Erhöhung der Reaktionstemperatur und Verlängerung der Reaktionszeiten konnten die restlichen Chloroliganden schrittweise weiter durch terminale Azidoliganden substituiert werden. So führte die Umsetzung von Cp*TaCl4 (1) mit einem zehnfachen Überschuss an Trimethylsilylazid bei Raumtemperatur nach 2-3 h zum disubustituierten Produkt Pentametylcyclopentadienyl-Diazido-Dichloro-Tantal-Dimer (19), der trisubstituierte Komplex Pentametylcyclopentadienyl-Triazido-Monochloro-Tantal-Dimer (20) entstand bei gleichem Überschuss an Me3SiN3 nach 18 h in siedendem CH2Cl2. Der Tetra(azido)-Halbsandwichkomplex (21) wurde schließlich erhalten, als die Ausgangsverbindung Cp*TaCl4 (1) mit einem zwanzigfachen Überschuss an Trimethylsilylazid drei Tage lang in Toluol am Rückfluß (110°C) erhitzt wurde. Triazolato-Halbsandwichkomplexe Triazolato-Halbsandwichkomplexe des Tantals wurden erhalten, wenn Cp*TaCl4 (1) mit den beiden silylierten Vorstufen 4,5-Di(methoxycarbonyl)-1-trimethylsilyl-1,2,3-triazol (40) und 4,5-Di(ethoxycarbonyl)-trimethylsilyl-1,2,3-triazol (41) zur Reaktion gebracht wurde. Unter Freisetzung von Trimethylchlorsilan wurde ein Chloroligand von 1 durch einen Triazolato-Liganden substituiert. Interessant war die in diesem Fall auftretende Koordinierung der Alkoxysauerstoffatome der Estergruppen von 42 und 43 in Position 5 an das Metallzentrum, gefolgt von einer intramolekularen Wanderung der Alkylreste an die Lewis-basischen Stickstoffatome in Position 3, wodurch fünfgliedrige Aza-oxo-metallacyclen entstanden. Phosphoraniminato-Komplexe An den Azidoliganden des Halbsandwichkomplexes Pentametylcyclopentadienyl-Triazido-Monochloro-Tantal-Dimer (20) wurde die Staudinger-Reaktion mit Triphenylphosphan durchgeführt. Im Laufe von 3 Tagen entstand in siedendem Toluol bei Anwesenheit eines Überschusses an Triphenylphosphan der azidoverbrückte Di(azido)-phosphoraniminato-Halbsandwichkomplex Pentametylcyclopentadienyl-Diazido-Chloro-Triphenylphosphoraniminato-Tantal-Dimer (52) Nach zweistündiger Bestrahlung einer THF-Lösung von 20 in Anwesenheit des gleichen Überschusses an Triphenylphosphan wurde ebenfalls 52 isoliert. Eine Umsetzung an sämtlichen Azidoliganden von 20, die zum einkernigen Komplex Cp*TaCl(N=PPh3)3 (53) führte, konnte nach einer Reaktionszeit von 6 Tagen in siedendem Toluol erreicht werden. Schließlich wurde die thermische Staudinger-Reaktion an 20 noch mit Tris(1-cyclohepta-2,4,6-trienyl)phosphan durchgeführt; nach einer Reaktionszeit von 5 Tagen in siedendem Toluol wurde der zweikernige Komplex Pentametylcyclopentadienyl-Diazido-Chloro-Tricycloheptatrienylphosphoraniminato-Tantal-Dimer (54) erhalten. Bis(trimethylsilyl)amido-Trimethylsilylimido-Komplexe Die Umsetzung von Cp*TaCl4 (1) mit zwei Äquivalenten Lithium-bis(trimethylsilyl)-amid führte unter Abspaltung von zwei Äquivalenten LiCl und einem Äquivalent Trimethylchlorsilan zum Halbsandwichkomplex Pentamethylcyclopentadienyl-chloro-bis(trimethylsilylamido)-trimethylsilylimido-tantal(V) (88). Das entsprechende einkernige Azidoderivat 94 wurde durch Umsetzung von 88 mit einem Überschuss an Trimethylsilylazid erhalten Am Azidoderivat von 88, dem Halbsandwichkomplex Pentamethylcyclopentadienyl-bis-(trimethylsilyl)amido-azido-trimethylsilylimido-tantal(V) (94) wurde eine photoinduzierte Staudinger-Reaktion unter Verwendung eines Überschusses an Triphenylphosphan durchgeführt. Das Produkt war 95, ein einkerniger Komplex, der sowohl Nitridobrücken zum Phosphor als auch zum Silicium enthält. Der entsprechende triethyl-substituierte Komplex 96 wurde durch Umsetzung von 88 mit Triethyl-phosphanimin (66) unter Verwendung von Triethylamin als Hilfsbase erhalten. Die einkernigen Komplexe 94-96 sind auch deshalb von besonderem Interesse, weil sie nebeneinander 3 unterschiedliche N-haltige Liganden in der Koordinationssphäre enthalten.
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Analysis of alkali-inducible genes of Bacillus subtilis
(2003)
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Akram Atalla
- Using the DNA macroarray technique, it could be shown that more than 80 genes induced after alkali shock (Wiegert et al., 2001). While most of them are under the control of the alternative sigma factor (sigmaW), the remaining genes are under the control of one or more unknown regulator(s). By their signature, two of them kipR and yvdT code for regulatory proteins, while pspA, member of the sigmaW regulon, encodes another potential regulator. In this doctoral work, the genes kipR, yvd and pspA were analyzed. The kipR and yvdT genes code for a transcriptional regulator of the IcIR and TetR/AcrR family while the pspA encode a transcriptional anti-activator in E. coli . In Northern blot analyses, it could be shown that all three genes are induced after alkali shock. The transcription start points of the kipR and yvdT genes were identified by primer extension experiments, and it appeared that the transcription is dependent on a vegetative sigma A-like promoter. To identify genes which are under the negative control of the transcriptional anti-activator PspA, a DNA macroarray experiment was carried out. It turned out that several genes are repressed by a factor of at least three under conditions of PspA overproduction. By using the Far-western blot technique, a protein which might interact with the PspA protein was identified. This protein has a molecular weight approximately 50 kDa. In addition, expression of the pst operon ( pst stay for phosphate-specific transport) was analyzed which is induced after phosphate starvation and after alkaline shock. The genes of this operon are involved in the phosphate transport into the cytoplasma. By Northern-blot experiments, it could be shown that all genes of this operon are alkali-inducible. When the transcriptional start point was determined by primer extension, it turned out to be identical to the one determined under phosphate limitation. This transcription start point is preceded by a typical sigmaA-type promoter. Furthermore, alkali-induction is dependent on the PhoP-PhoR two-component signal transduction system. Phosphate-uptake experiments revealed that the uptake of inorganic phosphate was completely abolished after increasing the external pH value.
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Diversität von Geometriden (Lepidoptera) und Gefäßpflanzen entlang von Habitatgradienten am Südwest-Kilimanjaro
(2003)
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Jan C. Axmacher
- Auf 63 Untersuchungsflächen am Südwesthang des Kilimanjaro wurden Zusammenhänge zwischen der Geometriden-Diversität und floristischer Diversität, Vegetationsstruktur und abiotischen Faktoren untersucht. Besonderes Interesse galt der Bergwaldregeneration, die auf 16 Flächen zwischen 2000 und 2350 m Höhe untersucht wurde. Entlang eines Höhentransektes, das sich vom unteren Kulturland bei 1200 m durch die Bergregenwaldstufe bis in die Ericaceenstufe in Höhen von 3700 m erstreckte, wurde die Änderung der Lebensgemeinschaften in Abhängigkeit von Höhenlage und Nutzungsintensität erfasst. Der Fang der Geometriden erfolgte an Leuchttürmen zwischen 19 und 22 Uhr, im zentralen Untersuchungsgebiet auch mit sieben automatischen Lichtfallen. Zum Anlocken der Falter wurden 15 W- Schwarzlichtröhren verwendet. Um die Leuchttürme herum wurden 400 m2 große Untersuchungsflächen ausgewiesen, auf denen alle Gefäßpflanzen nach Schichten getrennt erfasst und die Vegetationsstruktur aufgenommen wurde. Im zentralen Untersuchungsgebiet wurden an Leuchttürmen in 59 Fängen 118 Morphospezies und 2603 Falter aus der Familie Geometridae gefangen, mit den weniger effektiven Lichtfallen in 203 Fängen 77 Morphospezies und 662 Individuen. Die auf den zentralen Untersuchungsflächen aufgenommenen höheren Pflanzen verteilten sich auf 44 Familien und 98 Morphospezies. Die Artenzusammensetzung der Geometridenzönosen wie auch der Gefäßpflanzen änderte sich im Regenerationsverlauf. Die Artenzahl der Gefäßpflanzen nahm auf den Flächen insgesamt, in Baum-, Strauch- und Krautschicht, der Gruppe der Epiphyten und in den artenreichsten Pflanzenfamilien im Regenerationsverlauf von großen Lichtungen über junge und alte Sekundärwälder zu naturnahen Wäldern zu. Die Diversität der Geometridenzönosen, gemessen mit Fishers Alpha und Hurlbert Rarefaction, sowie die mit Chao 1 extrapolierte Gesamtartenzahl nahm dagegen ab. Die Werte von Fishers Alpha lagen bei sehr niedrigen Werten zwischen 3,4 und 17,8. Die Vegetationsstruktur korrelierte nur schwach mit der Zusammensetzung der Geometridenzönosen. Die Deckung der Moosschicht, ein Indikator für feuchte Verhältnisse, zeigte dabei die stärkste Korrelation. Im Höhentransekt wurden auf den Offenland-, Agroforst- und Waldflächen mit 212 Leuchtturmfängen insgesamt 304 Morphospezies und 8468 Einzeltiere aus der Familie der Geometridae gefangen. Wie im zentralen Untersuchungsgebiet war Mimoclystia corticearia (Larentiinae) die häufigste Art, gefolgt von Darisodes oritropha (Ennominae). Häufig waren auch Chiasmia fuscataria (Ennominae) aufgrund eines Massenvorkommens am unteren Waldrand sowie Chloroclystis derasata (Larentiinae). Bei den auf 51 Untersuchungsflächen durchgeführten Vegetationsaufnahmen wurden 451 Gefäßpflanzenarten aus 116 Familien erfasst. Die Gesamtartenzahlen der Gefäßpflanzen auf den Flächen schwankte zwischen 5 und 53. Sie zeigte auf den Wald- und Offenlandflächen keine Korrelation mit der Höhe, während sie auf den Agroforstflächen mit steigender Höhe signifikant zunahm, was auf die extensivere Nutzung höher gelegener Standorte zurückzuführen ist. Die Artenzahlen vaskulärer Epiphyten, der Aspleniaceen und Rubiaceen waren in mittleren Höhen zwischen 2200 und 2400 m am höchsten, während die Diversität der Baum- und Strauchschicht und der Leguminosen maximale Werte auf den unteren Flächen erreichte. Auch die Diversität der Geometriden war auf den unteren Flächen mit Fishers Alpha-Werten von maximal 40,2 am höchsten. Sie fiel im Transekt auf den Offenlandflächen gleichmäßig ab, während auf den Waldflächen im Bereich zwischen 1800 und 3100 m abgesehen von dem Bereich des zentralen Untersuchungsgebietes die Diversität bei Werten zwischen 8,3 und 12,5 annähernd konstant blieb. Die Analyse der Beta-Diversität und der Gesamtdiversität einzelner Höhenbereiche zeigte, das die Geometridenzönosen zwischen 2000 und 3000 m sehr homogen sind. Die Höhenlage erwies sich als „Master“-Variable, die einen starken Einfluss auf die Vegetationszusammensetzung wie auch die Zusammensetzung und Diversität der Geometridenzönosen hatte. In Bezug auf Geometriden sind insbesondere die feuchten Bergregenwälder am Kilimanjaro wenig divers. Dies kann auf die Insellage des Vulkans inmitten trockener Savannen, sein geringes Alter und die insgesamt arme afrikanische Lepidopterenfauna zurückgeführt werden. Neben dem Schutz der Bergregenwälder, der für die Aufrechterhaltung der Phytodiversität des Kilimanjaro wie auch für die Sicherung der Wasserversorgung Nordtansanias unerlässlich erscheint, sollte auch die traditionelle Agroforstwirtschaft erhalten bleiben, da sie eine hohe Diversität sowohl an Geometriden als auch an Pflanzenarten gewährleistet.
