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Studies on the influence of different diets and rearing conditions on the development and growth of the two-spotted cricket Gryllus bimaculatus de Geer
(2011)
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Hassan Ibraik Hassan EL-Damanhouri
- •The effect of rearing conditions and different diets on larvae and adults of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus de Geer (Orthoptera: Gryllidae), was studied. •The percent increase in body and ovary mass of adult females reared under crowded conditions was higher than that of those reared under isolated conditions. •Higher population density increased reproductive investment in adult females, regardless of the presence or absence of adult males. •The presence or absence of adult males appeared to have no significant effect on the pronotum width, increase in body mass, DLM mass and ovary mass of adult females. •Not only the population density plays an important role in morphological, physiological and behavioural changes, but also the absolute number of animals in a population may influence the above-mentioned parameters. •A strong positive correlation was found between increase in body and ovary mass and decrease in flight muscle and fat body mass; the loss of flight muscle and fat body mass is due to a high egg production. •Five different diets were used: standard diet (ca. 20 % protein, 4.5 % lipid, 45.5 % carbohydrate), modified standard diet (ca. 22 % protein, 6 % lipid, 42 % carbohydrate), and three semi-artificial diets, all containing 30 % protein but differing amounts of lipid (A: normal, B: low, C: high). •The amount of diet consumed highly depends on the type of diet given. •Weak relationships were obtained between increase in body mass and different amounts of diets consumed. •The amount of the different storage products in the fat body of 5-day-old adult females can be arranged in the following order: lipid, protein, glycogen and free carbohydrate. •The total lipid concentration in the haemolymph was generally much higher than carbohydrate concentration. •When fed on a high calory diet, the amount of food consumed was reduced. •When crickets were fed on artificial diets from penultimate larval stage, they displayed a lower increase in body mass and some reduction in flight muscle and ovary mass compared with crickets fed on artificial diet from the day of the adult moult only. •With respect to body and ovary mass, when fed to adult females modified standard diet was heartier, followed by diet A, B, C and standard diet. •When fed to penultimate larvae onwards, however, diets B and C resulted in a significantly reduced body and ovary mass. This indicates that when diets too low or too high in lipid content are fed for a longer period, cricket cannot compensate for it. •The development and reproductive investment of Gryllus bimaculatus shows a high degree of dependence on diet availability, diet quality and quantity, and food intake. Therefore, crickets raised on the different diets did not grow at equal rates. •The results unambiguously show that population density dramatically alters cricket behavioural, morphological and physiological characteristics; as a matter of fact there was a strong correlation between crowded conditions and an increase in metabolic rate, which in turn had an influence on the effects of different diets.
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Mikrobielle Kohlenstoff- und Stickstofftransformationen im Verdauungstrakt von Regenwürmern (Oligochaeta)
(2010)
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Pia Katharina Wüst
- Der Regenwurmverdauungstrakt ist eine einzigartige Mikrozone in belüfteten Böden, die ideale Bedingungen für mit der Nahrung aufgenommene Bodenmikroorganismen bietet. In vorangegangenen Studien wurde gezeigt, dass die Emission von N2O durch europäische Regenwürmer auf die Aktivierung von aufgenommenen Boden-Denitrifikanten zurückzuführen ist. Bisher ist nicht bekannt, ob die Emission von N2O ein universelles Merkmal von Regenwürmern ist. Zudem ist nicht vollständig geklärt, welche Gärungsprozesse im Verdauungstrakt des Regenwurms relevant und welche gärenden Taxa dort aktiv sind. Ziel dieser Arbeit war es, die Fähigkeit zur N2O-Emission bei neuseeländischen Regenwurmarten zu untersuchen sowie die Diversität potentieller Denitrifikanten im Verdauungstrakt und im umgebenden Boden zu bestimmen. Weitere Ziele waren, die in situ-Bedingungen entlang des Verdauungstrakts von Lumbricus terrestris mit den mikrobiellen C- und N-Transformationen in Verbindung zu setzen sowie metabolisch aktive und Glucose-verwertende Bacteria im Verdauungstraktinhalt zu identifizieren. Die in Neuseeland eingeführten Arten Lumbricus rubellus und Aporrectodea rosea (beide Familie Lumbricidae) emittierten N2O, während die eingeführte Art Octolasion cyaneum (Familie Lumbricidae) nur teilweise und die einheimische Art Octochaetus multiporus (Familie Megascolecidae) kein N2O unter in situ-Bedingungen emittierten. Das N2O-Emissionspotential des einheimischen Wurms war deutlich schwächer ausgeprägt als das der eingeführten Würmer. Die Diversität der Denitrifikantenpopulationen in Verdauungstrakten und umgebenden Böden von L. rubellus und O. multiporus wurden anhand der Analyse von N2O-Reduktasegenen (nosZ) bestimmt. NosZ Sequenzen aus den Verdauungstrakten waren sehr ähnlich zu nosZ Sequenzen aus den umgebenden Böden und verwandt zu unkultivierten Bodenbakterien. N2O und H2 wurden von europäischen Würmern emittiert. Höchste in situ-Konzentrationen von N2O wurden im Kropf/Magen und im Enddarm detektiert, während H2 im Vorder- und Mitteldarm höchste Konzentrationen aufwies. Analog dazu waren eine hohe N2O-Bildung von Wurmabschnitten der Kropf/Magen- und Enddarmregion und eine hohe H2-Bildung von Abschnitten der Mitteldarmregion zu verzeichnen. Diese Ergebnisse deuten an, dass Denitrifikation vornehmlich im Kropf/Magen und Enddarm stattfindet, während H2-freisetzende Gärungen im Vorder- und Mitteldarm dominieren. In situ-Mikrosensormessungen wiesen darauf hin, dass der komplette Verdauungstrakt sauerstofffrei ist. Das Redoxpotential lag im Verdauungstrakt zwischen -203 und +388 mV. Im Verdauungstraktinhalt kamen Saccharide und organische Säuren in hohen Konzentrationen vor. Monosaccharide nahmen entlang des Verdauungstrakts ab. Die höchste Konzentration und die größte Diversität an organischen Säuren wurden im Mitteldarm nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass mit der Nahrung aufgenommene Mikroorganismen während der Darmpassage sich ändernden Bedingungen ausgesetzt sind und unterstützen die Annahme, dass im Verdauungstrakt verschiedene anaerobe mikrobielle Prozesse in räumlicher und damit auch in zeitlicher Abfolge aktiv sind. In anoxischen Inkubationen von Verdauungstraktinhalt mit Glucose wurden Gase und lösliche organische Verbindungen gebildet, was auf die Aktivität verschiedener Gärungsprozesse im Verdauungstrakt hinweist. Mit Hilfe der 16S rRNA basierten Stabilen-Isotopenbeprobung wurden Clostridiaceae und Enterobacteriaceae als dominante Glucose-Verwerter des Regenwurmverdauungstrakts identifiziert. Weiterhin ergab die Analyse von 16S rRNA aus frisch entnommenem Darminhalt, dass 79 Familien metabolisch aktiv waren, wovon 17 als neue Familien-ähnliche Gruppen definiert wurden. Diese Ergebnisse (a) bestätigen frühere Erkenntnisse, welche die Emission von N2O und N2 durch Regenwürmer auf aktive Denitrifikation in deren Verdauungstrakt zurückführen und (b) zeigen, dass die Fähigkeit zur N2O-Emission auch bei Regenwürmern der südlichen Hemisphäre auftritt, jedoch unterschiedlich stark ausgeprägt sein kann. Weiterhin wurde demonstriert, (c) dass diverse und teilweise unbekannte Taxa im Regenwurmverdauungstrakt aktiv sind, (d) dass dort Clostridiaceae und Enterobacteriaceae sehr wahrscheinlich an der Verwertung von Sacchariden beteiligt sind und (e) dass aufgenommene obligate Anaerobier und fakultative Aerobier gleichzeitig dieselbe Kohlenstoffquelle nutzen können. Prozessorientierte Inkubationsversuche, in situ-Messungen mit Mikrosensoren, die Charakterisierung der in situ-Bedingungen entlang des Verdauungstrakts sowie die molekularbiologische Analyse der Glucose-verwertenden und denitrifizierenden Bakterien aus dem Verdauungstrakt legen die Schlussfolgerung nahe, dass Regenwürmer durch anaerobe mikrobielle Aktivitäten in ihrem Verdauungstrakt zum terrestrischen C- und N-Kreislauf in belüfteten Böden beitragen und eine bedeutende mobile Elektronenquelle (in Form von emittiertem H2) für die Mikrobiota in diesen Böden darstellen.
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Construction of an efficient secretion system for recombinant proteins in Bacillus subtilis
(2011)
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Kelly Cristina Leite
- All proteins being translocated through the cytoplasmic membrane of bacteria cells as well as some proteins that are inserted into the cytoplasmic membrane contain a signal sequence at their N-terminus that is recognized by and targeted to the translocation machinery. Three translocation pathways have been described, so far in E. coli to allow secretion of proteins: The Sec, the Tat and the SRP (Signal Recognition Particle) pathway. While the Sec and the Tat pathway act post-translationally and accept unfolded and correctly folded polypeptides, respectively, the SRP pathway acts co-translationally. For proteins secreted through the cytoplasmic membrane via the Sec pathway, the ATP-dependent motor protein SecA is required for translocation. The translocation process of some proteins following the SRP pathway has also shown to be enhanced by the presence of SecA. The Sec and the SRP pathway share the heterotrimeric protein-conducting channel translocon complex composed of the SecYEG proteins. Based on the known characteristics of both pathways, the goal of this PhD project was to construct an efficient secretion system for recombinant proteins in Bacillus subtilis using an a-amylase as a reporter enzyme, which is secreted into the medium using the Sec pathway. Its gene amyQ was fused to an IPTG-inducible promoter. It turned out that increasing amounts of IPTG did not result in a concomitant increase of secreted a-amylase. Overproduction either formed aggregates within the cytoplasm or preproteins targeted to the translocon jammed the membrane. To release the accumulated protein within the cells two different experiments were carried out: i) a co-production and overexpression of SecA, and; ii) overexpression of an artificial secYEG operon. First, increased production of SecA showed significantly decrease in the total synthesis and secretion of a-amylase and did not reduce cytoplasmatic accumulation or membrane jamming. Second, the artificial operon enhanced expression of secY, secE and secG genes resulted in a higher amount of reporter enzyme secreted into the medium. Furthermore, two different experiments using the transposon mutagenesis strategy were carried out in order to screen for B. subtilis mutants able to increase secretion of α-amylase. Transposon mutagenesis was performed with the mariner-based transposon to inactivate gene(s) whose product might regulate directly or indirectly the secretion of α-amylase. No mutant strain presenting a higher secretion of α-amylase on indicator plates was found. In addition, I devised a modified transposon containing a xylose-expression cassette. To test the efficiency of the modified transposon, the promoter-less cat gene was used as a reporter gene and integrated into the B. subtilis chromosomal DNA. After transposon mutagenesis, mutants expressing the promoter-less cat gene were isolated. This result indicates that the modified transposon might lead to increased production of a gene in the presence of xylose and that this product might then enhance secretion of α-amylase to be detected on indicator plates. In the third part of my thesis, a terminator-test vector was constructed which should allow the identification of strong terminators acting as 5'-stabilizing element. This vector consists of an artificial bicistronic operon containing the two reporter genes bgaB and gfp allowing the insertion of the terminators between the two genes. Insertion of a terminator should lead to a reduction of the amount of GFP. The system was verified with the known sinIR transcriptional terminator. It turned out that the vector with the two reporter genes already exhibited instability in E. coli.
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Soziale Prozesse der Selbstregulation einer Wildkaninchenpopulation (Oryctolagus cuniculus L.)
(2010)
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Paul Ernst Kaetzke
- Wahrend einer Populationsstudie von Wildkaninchen innerhalb eines 22000 m2 großen Freigeheges wurden strukturelle und demographische Parameter über 16 Jahre aufgenommen. 1. Populationsdynamik: Trotz einer jährlichen Produktion von 258-1080 Jungtieren verblieb die Adulttierdichte stabil und schwankte nur um etwa 50 Tiere. Die Populationsgröße wird in Abhängigkeit von ihrer Dichte und Altersaufbau reguliert, was ihren Ausdruck in einem Zyklus der Wachstumsrate mit einer Periode von ca. 5 Jahren findet. 2. Sozialstruktur: Wildkaninchen leben in Mischeinheiten mit geschlechtsspezifischen linearen Dominanzhierarchien, die durch das Territorialverhalten von Männchen voneinander isoliert sind. Innerhalb von Männchenterritorien können Weibchen Untergruppen bilden. 3. Populationsdynamische Faktoren Jahreszeit: In der Nichtreproduktionszeit bleiben strukturbildende Verhaltensweisen erhalten. Dichte: Mobilität und strukturbildende Verhaltensweisen, wie rangabhängiges nahes Beisammensitzen, aggressives Verhalten und Hüteverhalten sind dichteabhängig. 4. Sozialdynamik Folgende Mechanismen regulieren und stabilisieren die Gruppengröße während der Abnahme der Populationsdichte: Männchen: Dominante Männchen vergrößern ihre Reviere; subdominante Männchen wandern in Gruppen mit vielen Weibchen ab und / oder ersetzen verstorbene dominante Männchen. Subdominante Männchen pendeln zwischen zwei Revieren. Reviere werden von dominanten und subdominanten Männchen verteidigt. Weibchen: Weibchen aus Gruppen mit wenig Raum wandern in Gruppen mit mehr Raum ab. Weibchen großer Gruppen wandern in kleine Gruppen ab. Weibchen erhalten ihre kleine Gruppengröße durch Territorialverhalten. Weibchen großer Gruppen spalten sich und bilden Untergruppen. Männchen und Weibchen: Individuelle Bindungen können bei Mangel an Männchen beobachtet werden. Folgende Mechanismen destabilisieren das System und können zu einer Erhöhung der Populationsdichte führen. a) Eine begrenzte Kapazität der Männchen, Reviere zu vergrößern und zu verteidigen; b) ein Mangel an Männchen, der zur Neubildung von Weibchengruppen führt, die disharmonisch sind; c) eine Abnahme der Weibchengruppengröße, die zu klein werden, um gegen eine Emigration von Weibchen aus größeren Gruppen verteidigt zu werden. 5. Funktion der Prozesse Strukturell-funktionale Aspekte: Männchen erhöhen bzw. erhalten ihren Zugang zu Weibchen durch Zusammenschluß in Dominanzhierarchien, Verbesserung des sozialen Status sowie durch Vergrößerung ihrer Reviere. Weibchen erhöhen bzw. erhalten ihren Zugang zu Wurfbauten durch Zusammenschluß in Dominanzhierarchien bzw Untergruppen, durch Verbesserung des sozialen Status und Abwanderung in Gruppen mit mehr Raum. Reproduktion: Eine Reproduktionssupression konnte nur auf der individuellen Ebene in Abhängigkeit von der Gruppengröße und dem Rang festgestellt werden. Die Reproduktionssuppression wirkt sich bei hoher Dichte auf die Wurfsynchronisation aus. Verwandtschaft: Eine geringer matrilineare Verwandtschaftsgrad innerhalb der Gruppen wird verursacht durch einen Generationsaustausch, Abwanderung und Geschwistertrennung. Homoöstase: Die Ausbildung sozial stabiler Beziehungen puffert direkte Konkurrenz ab, was sich in der Erniedrigung der Nebennierenrindenaktivität (NNR) äußert. Soziale Veränderungen bewirken unabhängig vom Rang eine Erhöhung der NNR. Copingstrategien wie Konfrontation bzw. Konfliktvermeidung können in Sozialbindungen und damit einhergehenden Ortsbindungen resultieren, die sich gegenläufig zu rangabhängigen NNR auswirken. Aufgrund der Komplementarität von Verhalten, sozialen Prozessen und Positionen mit der Lebenserwartung von Tieren können über die NNR Rückschlüsse auf die Befindlichkeit von Tieren, wie Sicher-, Unsicherheit und Selbstvertrauen getroffen werden. 6. Vernetzung: Strukturell-funktionale Mechanismen selbstorganisieren die horizontale Vernetzung der Population in unterschiedlich zusammengesetzte Gruppen. Innerhalb der Population bestimmen endogene Mechanismen der Sicherheit von Individuen die Selbstorganisation in soziale Gruppen. Sie sind das Ergebnis zentrifugaler Kräfte positiver Rückkopplungsprozesse eines Aggressionsvermeidungssystems sowie der zentripetalen Bindungskräfte von Wurfbauen und Paarungspartnern. 7. Lebensgeschichte und Demographie: Dichteabhängige Oszillationen sind gebunden an die Alters- und Geschlechterzusammensetzung der Population. Dies kann als zirkuläre Geschlossenheit von Ursache und Effekt des Auf- und Abbaus eines sozialen Netzwerkes als Regel generierendes (konstitutives) und Regel basierendes (evaluatives) System der Prozesse, die soziale Unsicherheit reduzieren, verstanden werden. 8. Synthese: Die Populationsdynamik der Jungtiere lässt sich allein aus der systemhaften Vernetzung von Populationsparametern formalisieren und vorhersagen.
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Resurvey of a GLORIA Target Region in the Swiss National Park
(2011)
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Frank Breiner
- There is no doubt that recent global climate change is in process and affects life on earth. Especially mountain ecosystems are supposed to be highly sensitive to climate change due to the vertical compression of life zones, rough abiotic environment and limiting ecological factors. Therefore, the European Alps is one of the best observed ecosystems where many studies figured out how climate change is affecting biodiversity. Probably the biggest and most well-known project is the GLORIA-Europe initiative established by Prof. Dr. Georg Grabherr from University of Vienna. The aim of this project is to establish a world-wide long-term monitoring network in alpine ecosystems to detect effects of climate change on the vegetation of mountain summits using standardised methods. This study is involved in the GLORIA initiative to resurvey four calcareous and four siliceous summits at Swiss National Park in summer 2009/10. The aim of this study is to answer the questions if there are changes between the first (2002/03) and second survey in plant species number, species frequency and in heterogeneity between plots. Furthermore, is altitude, cardinal direction and bedrock influencing changes or are there species groups reacting different and what are the reasons behind it? In total 226 species were found in 2009 and 2010 with almost 80% more species on the siliceous summits. Species turnover rate between the two surveys is relatively high (15-30%) and also frequency is increasing for several species. But, there are no effects of bedrock or exposition and no differences for species groups. This study shows that fluctuation of species turnover is due to fluctuation of phenological development. Furthermore, differences in plot heterogeneity can be explained by phenological fluctuation. However, there are hints for initiating effects of climate change. The occurrence of L. decidua on three lower summits and the high content of new found species with a lower distribution limit at the montane belt on PMU as well as general increase in plant frequency could be caused by climate change. Hence, these hints of climate change should be focused on in future investigations as long-term effects of climate change are expected.
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Untersuchungen zum Wissenserwerb, zur kognitiven Belastung und zu emotionalen Faktoren im experimentellen Unterricht über Grundlagen der Gentechnik im Lernort Labor unter besonderer Berücksichtigung von Schülervorstellungen (am Beispiel des Demonstrationslabors Bio-/Gentechnik der Universität Bayreuth mit Schülern der 10. Klasse Realschule)
(2010)
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Gaitano Franke
- Gentechnik ist ein aktuelles Thema des Biologieunterrichtes der 10. Jahrgangsstufe des Lehrplans der sechsstufigen Realschule in Bayern. Um eine praktische Auseinandersetzung mit dieser Thematik zu ermöglichen, wurde das Demonstrationslabor Bio-/ Gentechnik des Lehrstuhls Didaktik der Biologie an der Universität Bayreuth seit 2007 erstmals auch für dieses Schülerklientel zugänglich gemacht. In einem mehrstündigen Praktikumsunterricht wurden 293 Schülerinnen und Schülern aus 13 nordbayerischen Realschulklassen Grundlagen der Gentechnik näher gebracht, indem Experimente zu den einzelnen Schritten eines Klonierungsversuchs (Restriktion und Ligation von DNA, Transformation von E. coli- Bakterien, Ausplattieren von Bakterien) durchgeführt wurden. Gleichzeitig zu den Praktika wurden drei Begleitstudien durchgeführt, deren Zweck die Evaluation des Unterrichtserfolgs war: Hierbei sollte überprüft werden, welche Auswirkungen der Praktikumsbesuch auf verschiedene kognitive Faktoren, wie den Wissenserwerb oder die geistige Anstrengung, aber auch auf affektive Faktoren, wie situationsbezogene Emotionen (z.B. Interesse und Wohlbefinden), hat. Weiterhin sollte der Frage nachgegangen werden, ob ein Konzeptwechsel in diesem Rahmen möglich ist. Ein Schwerpunkt lag dabei auf der Beobachtung der Auswirkungen einer Berücksichtigung von Schülervorstellungen im Unterricht. Zu diesem Zweck wurden die Schülerinnen und Schüler klassenweise auf zwei Interventionsgruppen (I-1, I-2) verteilt. Beide Gruppen erhielten im Demonstrationslabor denselben experimentellen Unterricht mit dem Unterschied, dass die Lernenden in I-2 zusätzlich mit Schülervorstellungen zur Gentechnik konfrontiert wurden. Dazu wurden in einer zuvor durchgeführten Studie die Vorstellungen von 144 Schülerinnen und Schülern zu acht Begriffen und Prozessen der Gentechnik erfasst und kategorisiert sowie anschließend in die Unterrichtskonzeption integriert. Die unterrichtliche Umsetzung orientierte sich dabei an einem konstruktivistischen Lehrmodell. Die Ergebnisse der drei Begleitstudien ergaben, dass sich die Behandlung von Schülervorstellungen im Unterricht in vielerlei Hinsicht positiv auf die Lernenden auswirkte: So zeigten sich die Schülerinnen und Schüler der Gruppe I-2 interessierter und fühlten sich wohler. Auch erzielten sie signifikant bessere Ergebnisse im Wissenstest, der im Anschluss an den Unterricht durchgeführt wurde, bei gleichzeitig verringerter geistiger Anstrengung. Es ist auch in dieser Gruppe gelungen, einen Konzeptwechsel zugunsten der fachwissenschaftlichen Vorstellungen zu erzielen. Hervorzuheben war die besondere Wirkung der Konfrontationsmethode auf die Schüler, die sich durch die Berücksichtigung ihrer Vorstellungen - im Gegensatz zu Schülerinnen - verstärkt angesprochen fühlten. Ausgehend von diesen positiven Ergebnissen empfiehlt es sich, die Erfassung von Schülervorstellungen auf weitere Themen auszudehnen, um es den Lehrern zu ermöglichen, in vielen Unterrichtssituationen auf diese zurückgreifen zu können.
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Development of Bacillus subtilis spores and cells for surface display of proteins
(2011)
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Quynh Anh Nguyen
- Surface display has attracted the attention of researchers in developing efficient display systems expressing heterologous polypeptides on the surface of bioparticles such as phages, bacterial and eukaryotic cells and bacterial spores. Among these bioparticles, the endospore from B. subtilis has advantages, including feasibility of production, safety feature, the robustness of the bacterial spore allowing storage in the desiccated form, a technological platform supported by extensive tools for genetic manipulation and less size restrictions of the displayed proteins compared to cell- and phage-based systems. A strategy to engineer B. subtilis spores to display heterologous protein on their surface is to use outer spore coat proteins (CotB, CotC, CotG) or an inner-coat protein (OxdD) with the coat genes’ transcriptional and translational signals as carriers (Isticato et al., 2001; Mauriello et al., 2004; Hinc et al., 2010; Zhou et al., 2008a; Potot et al., 2010; Kim et al., 2005a; Kwon et al., 2007). This strategy guarantees the timing for fusion protein synthesis during coat formation, but the amount of produced fusion proteins cannot be controlled. Therefore, the first aim of this doctoral thesis focused on construction of more effective expression systems for spore surface protein anchoring. A novel approach of substitution of native promoter by two different IPTG-inducible promoters to the increase the production of fusion protein is presented here. CotB was used and the expression of the cotB gene was regulated by either its own promoter, the Pgrac and the PSgrac promoter in a series of plasmids which can be integrated into or replicated independently of the B. subtilis chromosomal DNA. Two reporter proteins, α-amylase Q from B. amyloliquefaciens (AmyQ) (Palva, 1982) and GFPuv – an enhanced version from the GFP protein of the jellyfish Aequorea victoria (Crameri et al., 1996), were fused downstream of the CotB protein. To assess the enhancement of GFPuv displayed on the spore surface, CotC and CotG were similarly examined. The results indicated that the Pgrac promoter is a suitable, hence recommended as a promoter of choice. Substitution of the native promoter by Pgrac promoter, the amount of proteins displayed per spore can be increased two-fold. Furthermore, the display of heterologous proteins on the spore surface when using different carriers is gene dosage dependent. And for the first time, the tendency of the three Cot proteins’ localization on the spore coat compartment is reported using the GFPuv tag. Second, a new B. subtilis spore-based system for protein expression and purification was developed. Using this system, proteins prone to form inclusion bodies can be anchored on the spore surface, separated by a mini-intein derived from the SSp DnaB, which was then used as self-cleaving tag for purification by shifting the pH and/or temperature conditions, with no addition of any proteases or thiol reagent (Mathys et al., 1999). To construct the system, the mini-intein was fused downstream of the CotB protein, followed by the reporter protein AmyQ. By changing the pH of the buffer, the mini-intein self-cleaving process was induced followed by the release of α-amylase into the supernatants. This observation suggests the use of the B. subtilis spores as an effective and low cost tool for protein purification. However, concerns related to premature of the pH-inducible mini-intein and auto-release of coat protein raise the question about the stability of the fusion coat-heterologous protein on the spore surface using the system. Hence, further investigation is needed to achieve a usable spore-based purification system. The last aim of the thesis was to apply the newly constructed B. subtilis spore display and the cell surface display systems (Nguyen and Schumann, 2006) to generate cellulose chips, in which enzymes were immobilized on the surface of microorganism cells or spores. The cellulase A (CelA) from C. thermocellum (Beguin et al., 1985) was utilized as a model enzyme. Unfortunately, the results showed an ineffective anchoring of CelA on the cell wall. This indicates the unsuccessful creation of cell-based cellulase chip when using the SrtA transpeptidase. In contrast, CelA was verified to be successfully displayed on the spore surface using CotB and CotG, but not CotC, as carriers. In general, a large volume of culture (up to one liter) must be prepared containing both cells and spores displaying CelA on the surface to assure sufficient CMC degradation. This might indicate a low activity of CelA. Further works should be done in selection of cellulase and improvement of the systems to generate the more effective cellulase chips.
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Chromosome dynamics during cell divisions in Drosophila melanogaster: The role of Rad21 in meiotic cohesion and dynamic analysis of the condensin subunit CapG in early embryonic mitotic divisions
(2010)
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Sonal Nagarkar
- Faithful segregation of genetic material is an essential hallmark of cell division. In eukaryotic cells, the DNA is replicated during S phase into two identical copies, which reside intimately paired (cohesed) in the nucleus as dispersed and entangled interphase chromatin fibers. At the onset of mitosis, the chromatin fibers start to resolve and by the end of metaphase they are compacted and individualized into a pair of cylindrical structures called sister chromatids, which remain connected until anaphase onset by residual sister chromatid cohesion in their centromeric regions. The compaction process is known as chromosome condensation, which is a prerequisite for accurate segregation of sister chromatids in anaphase. Chromosome condensation and sister chromatid cohesion require multisubunit protein complexes, the condensin and the cohesin complexes, respectively. Both complexes are composed of two core SMC subunits and a set of non-SMC subunits, which are conserved among most eukaryotes. In the first part of my thesis, I have analyzed the localization and dynamic behavior of a functional, EGFP-fused variant of CapG, one of the non-SMC subunits of the condensin I complex in Drosophila melanogaster. In vivo fluorescence microscopy of early embryonic mitotic divisions revealed that CapG-EGFP is mainly nuclear during interphase and that it starts to enrich at centromeric proximal regions in late interphase. Thereafter, CapG-EGFP spreads onto the chromosome arms concomitantly with the initiation of chromosome condensation (ICC) and loading is complete already in prophase at the time of nuclear envelope breakdown. Furthermore, FRAP analyses revealed that a major proportion of CapG-EGFP is stably bound to chromatin during metaphase and only a minor fraction shows a dynamic association with chromatin. These results are similar, but not identical, to findings previously obtained for another non-SMC subunit, CapH/Barren, suggesting interactions of the individual non-SMC subunits with chromatin outside a bona fide condensin complex. Since a non-SMC cohesin subunit homologous to the typical meiotic Rec8 protein found in other eukaryotes appears to be missing in Drosophila, I have assessed in the second part of my thesis a possible cohesive role for the mitotic subunit Rad21 during female meiosis. Furthermore, a potential redundancy during oogenesis between Rad21 and another candidate cohesin subunit, C(2)M, was analyzed. Forced proteolysis of Rad21 during oogenesis resulted in delocalization of the canonical cohesin core subunit Smc1 from oocyte chromatin. Furthermore, immunofluorescence and fluorescence in situ hybridization analyses revealed a high proportion of premature homolog disjunction and premature sister chromatid separation in the developing mutant oocytes and also during the meiotic divisions. Moreover, it was established that Rad21 has a role in the maintenance of the synaptonemal complex (SC), as shown by delocalization of the transversal SC component C(3)G. Taken together, these results suggest that Rad21 is indeed involved in sister chromatid cohesion during female meiosis in D. melanogaster. Since in the absence of Rad21 and the concomitant presence of C(2)M meiotic sister chromatid cohesion is compromised, Rad21 appears to play the major role in meiotic sister chromatid cohesion in D. melanogaster and a functional redundancy between C(2)M and Rad21 is unlikely.
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Effektivität von interaktivem außerschulischem Unterricht vor dem Hintergrund der Cognitive Load-Theorie
(2010)
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Barbara Meissner
- Anspruchsvolle Lernumgebungen zeichnen sich dadurch aus, dass Schüler über den reinen Wissenserwerb hinaus viele kognitive Ressourcen für die Anwendung von Schlüsselkompetenzen (Koordination, Zusammenarbeit, Planung, Orientierung, …) aufwenden müssen. Eine Förderung dieser Kompetenzen ist Bestandteil der Lehrpläne und der nationalen Bildungsstandards (KMK 2005), ihre Bedeutung für den Alltag und das spätere Berufsleben sind wohl unumstritten. In der vorliegenden Studie wurden die Schüler mit einer neuartigen, außerschulischen Umgebung konfrontiert, und sie mussten schülerzentriert in einer Gruppe mit Klassenkameraden praktische Tätigkeiten ausführen: Das Unterrichtsprojekt am Salzbergwerk Berchtesgaden umfasste fünf Versuche, die zentrale Eigenschaften von Kochsalz altersgerecht und anschaulich vermitteln . Sowohl außerschulischer Unterricht als auch interaktives Lernen (Gruppenarbeit, experimentelles Arbeiten) sind sehr anspruchsvoll. Sie verursachen zusätzliche (wirkungslose) kognitive Last, die unabhängig von der reinen Auseinandersetzung mit dem Thema (intrinsische kognitive Last) und den damit verbundenen Lernprozessen (wirksame kognitive Last) ist (z. B. Kirschner et al. 2006, Sweller et al. 1998, Hofstein und Lunetta 2004). Um eine Überlastung des Arbeitsgedächtnisses zu vermeiden und dennoch der Forderung nach Kompetenzförderung gerecht zu werden muss deshalb in anspruchsvollen Lernumgebungen besonders auf ein sorgfältiges Unterrichtsdesign geachtet werden. Die Theorie der kognitiven Last (Sweller et al. 1998, Sweller 2010) diente in der vorliegenden Arbeit als Richtlinie für das instruktionale Design. In Teilstudie A konnte gezeigt werden, dass der Lernort selbst nur bedingten Einfluss auf kognitive wie affektive Resultate hat: Eine Durchführung am Salzbergwerk und an einem neutralen Lernort ohne Bezug zum Thema ‚Salz führten zu keinen signifikanten Unterschieden im Lernerfolg und im motivationalen und emotionalen Feedback der Schüler. In den Teilstudien B und C wurde die Eignung der Theorie der kognitiven Last (Sweller et al. 1998, Sweller 2010) als Richtlinie für das instruktionale Design außerschulischer naturwissenschaftlicher Lerneinheiten überprüft. Dazu wurden Cluster entsprechend der individuellen Effektivität des Unterrichts gebildet. Etwa die Hälfte der Schüler zeigte sehr gute Ergebnisse, jeweils etwa ein Viertel hätte besser abschneiden können bzw. lieferte schlechte Resultate. Analysen auf kognitiver und motivationaler Ebene bestätigten die Eignung der Theorie der kognitiven Last als Grundlage für die Ausgestaltung anspruchsvoller naturwissenschaftlicher Lernumgebungen. Es konnte lediglich ein fehlendes Element identifiziert werden: Die Ergebnisse der Teilstudien B und C zeigten, dass mit intensiverer Anleitung, z. B. in Form gezielter Fragen und ermutigenden Feedbacks, die meisten Defizite vermutlich hätten ausgeglichen werden können. Angemessene Anleitung wird zwar im Rahmen der Theorie der kognitiven Last gefordert (van Merrienboer et al. 2006), es werden jedoch keine Spezifikationen gegeben, welchen Kriterien diese im naturwissenschaftlichen Unterricht genügen sollte. Anhaltspunkte für weitere Überlegungen sind vorhanden (van Merrienboer et al. 2006) und sollten als Grundlage für zukünftige Studien herangezogen werden. Die vorliegende Gesamtstudie zeigt, dass effektives und effizientes Lernen in anspruchsvollen Lernumgebungen möglich ist. Die Eignung der Theorie der kognitiven Last wurde bestätigt, wobei der Aspekt der adäquaten Anleitung im naturwissenschaftlichen Unterricht noch weiterer Forschung bedarf. Ein besonderes Anliegen war es, die Bedeutung adäquater Anleitung zu betonen, deren systematische Erforschung und Umsetzung in vielen Forschungsbereichen bislang eher zu kurz kam. Diese Arbeit trägt zu einer Verbesserung von Unterricht in anspruchsvollen Lernumgebungen bei, indem sie Faktoren aufzeigt, die Vermittlung von Wissen effektiv und effizient mit individueller Kompetenzförderung zu verknüpfen.
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Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen mitochondrialer Morphologie, Alterung und Apoptose in Saccharomyces cerevisiae
(2010)
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Mark Dürr
- Mitochondrien üben viele essentielle Funktionen in eukaryotischen Organismen aus. Ihre Aufgaben bestehen zum Beispiel in der Bereitstellung von Energie in Form von ATP durch die oxidative Phosphorylierung sowie in der Bildung von Eisen-Schwefel-Clustern. Mitochondrien bilden ein Netzwerk, dessen Form sich hochdynamisch an spezifische Bedingungen und Änderungen im Metabolismus anpassen kann. Die Bedeutung einer intakten Dynamik wird dann offensichtlich, wenn man die Auswirkungen der Fehlregulierung dieses Prozesses betrachtet. Die Störung der mitochondrialen Fusion geht in Säugern mit einer Reihe von schweren Erkrankungen, wie Charcot-Marie-Tooth Neuropathie Typ 2A oder Dominanter Optischer Atrophie einher. Zudem spielen Mitochondrien und die mitochondriale Dynamik eine zentrale Rolle beim programmierten Zelltod (Apoptose). Die Fragmentierung der Mitochondrien ist dabei ein entscheidender Schritt beim Ablauf dieses Prozesses. Auch in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, einem fakultativ anaeroben eukaryotischen Organismus, spielen mitochondriale Teilung und Fusion eine wichtige Rolle bei der Apoptose. Bis heute sind jedoch kaum negative Auswirkungen fehlgesteuerter mitochondrialer Dynamik auf andere Prozesse wie Zelldifferenzierung oder Alterung in Hefezellen bekannt. In dieser Arbeit wurde der Effekt von gestörter mitochondrialer Teilung und Fusion auf die Sporulation von Hefezellen sowie auf deren Lebensdauer untersucht. Dabei wurde auch der Zusammenhang zwischen Apoptose und Zellalterung in Hefekulturen näher betrachtet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Deletion von Mdm30 (mitochondrial distribution und morphology protein 30), einem Regulator des mitochondrialen Fusionsproteins Fzo1 (fuzzy onions homolog 1), zu einer eingeschränkten Sporulationseffizienz sowie zu mitochondrialen Vererbungsdefekten in den einzelnen Sporen führt. Des Weiteren zeigten die Untersuchungen, dass eine intakte mitochondriale Dynamik ausschlaggebend für die Alterung von Hefekulturen ist. Die gleichzeitige Blockade der mitochondrialen Fusion und Teilung durch Deletion der Fusionskomponente Fzo1 und des mitochondrialen Teilungsproteins Dnm1 (dynamin-related protein 1) hat negative Auswirkungen auf das Wachstum und die Fitness der Hefekulturen. Der mitochondriale Fusionsdefekt führt zudem zu einer stark herabgesetzten chronologischen Lebensdauer verbunden mit verstärkter Apoptose der Hefezellen. Eine direkte Blockade der Apoptose durch die Deletion des proapoptotischen Faktors Yca1 (yeast caspase 1) führt ebenfalls zu einer Reduktion der chronologischen Lebensdauer von Hefekulturen. Interessanterweise verlängert die gleichzeitige Inkubation der Mutante mit wildtypischen Zellen die Lebensdauer der Δyca1-Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Hefekulturen vom programmierten Zelltod einzelner Zellen profitieren können, was zu einer Verlängerung der chronologischen Lebensspanne führt. Obwohl Sinn und Nutzen des programmierten Zelltodes für S. cerevisiae immer noch kontrovers diskutiert werden, liefern die in dieser Arbeit erzielten Erkenntnisse weitere Argumente für die Notwendigkeit der Apoptose für diese einzelligen Organismen.
