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Analyse von Condensin-Komplexen in Drosophila melanogaster Charakterisierung der Untereinheit CapG und Identifizierung von Interaktionen
(2012)
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Sabine Herzog
- Die akkurate Verteilung der Chromosomen während der Mitose ist essentiell für die genetische Stabilität der Zellen. Der heteropentamere Condensin-Komplex ist hierbei an der Strukturierung der Chromosomen und deren physikalischer Stabilität während der Segregation maßgeblich beteiligt. In höheren Eukaryoten konnten zwei dieser Komplexe (Condensin I und Condensin II) identifiziert werden, die ihrerseits eine distinkte subzelluläre Lokalisation während der Interphase und auch Beladung an das mitotische Chromatin aufweisen. Die beiden Komplexe haben die Structural maintenance of chromosomes (SMC) Untereinheiten SMC2 und SMC4 gemein, während sie sich in den nicht-SMC-Untereinheiten unterscheiden: In Condensin I findet man die Komponenten Chromosome associated protein D2 (CapD2), CapG und CapH und in Condensin II die verwandten Proteine CapD3, CapG2 und CapH2. Während in Vertebraten die Rolle beider Condensin-Komplexe während der Mitose klar etabliert ist, zeichnet sich in Drosophila melanogaster ein anderes Bild ab. Mutanten in den Genen CapH2 und CapD3 zeigen keine mitotischen Phänotypen und ein zu CapG2 homologes Protein konnte bisher nicht identifiziert werden. Da CapG aus Drosophila ein ähnliches Lokalisationsverhalten wie die Condensin II-Untereinheiten der Vertebraten aufweist, wird CapG als Komponente beider Condensin-Komplexe diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktion und die Regulation von CapG in Drosophila melanogaster, primär durch die Analyse von EGFP-fusionierten Proteinvarianten, näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von CapG neben den hauptsächlichen Phosphorylierungsstellen auch Kernimportsequenzen enthält, welche die subzelluläre Lokalisation des Proteins während des Zellzyklus regulieren. Während der Interphase zeigt CapG im Zellkern eine Kolokalisation mit dem Heterochromatin-bindenden Protein HP1, was auf eine direkte Chromatinassoziation von CapG hinweist und mögliche Chromatin-strukturierende Funktionen bestätigen würde. Diese Heterochromatin-spezifische Lokalisation kann vom C-terminalen Drittel von Cap-G vermittelt werden, der andererseits für die generelle Chromatinassoziation während der Mitose, die Interaktion mit den anderen Condensin I-Untereinheiten und für die Funktionalität von CapG während der somatischen Mitosen entbehrlich ist. Da ein Proteinfragment entsprechend der N-terminalen Zwei-Drittel von CapG (CapG-NM) während der Interphase hauptsächlich zytoplasmatisch lokalisiert ist, kann die präferentielle Kernlokalisation von CapG während der Interphase, und auch die Phospho-Regulation des Proteins, für die Entwicklung vom Beginn der embryonalen zygotischen Expression bis hin zum adulten Stadium nicht essentiell sein. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Lokalisation von CapG und anderen Condensin Untereinheiten in Geweben der weiblichen und männlichen Keimbahn legt die Vermutung nahe, dass CapG, eventuell im Kontext mit den anderen Condensin-Untereinheiten, eine Rolle bei der Gametogenese zukommt. Konsistent hiermit ist die Beobachtung, dass Weibchen steril sind, die in ihren Keimbahnzellen keine funktionelle CapG-Variante exprimieren. Die Integrität der Ovarien in diesen Tieren spricht für eine Funktion von CapG bei der Reifung des Oozytenkerns oder den meiotischen Teilungen. Die Präsenz von CapG in löslichen Komplexen mit den bekannten Condensin I-Untereinheiten konnte in dieser Arbeit durch Koimmunpräzipitationen mit nachfolgender massenspektroskopischer Bestimmung der assoziierten Proteine bestätigt werden. Eine Assoziation mit Condensin II-spezifischen Untereinheiten wurde dagegen nicht gefunden. Ebenso assembliert eine ektopisch exprimierte, funktionelle Variante von CapH2 nicht in einem löslichen Komplex mit CapG. Auch die Analyse direkter Protein-Protein-Interaktionen in einem in vitro-System ergab keine Hinweise auf eine Assoziation von CapG mit Condensin II-spezifischen Untereinheiten. Dagegen konnten in diesem System die Interaktionen nachvollzogen werden, die für Condensin I und Condensin II aus anderen Systemen publiziert und somit erwartet sind. Experimente zur genetischen Interaktion der Condensin-Untereinheiten offenbarten bei Anwesenheit von CapG-Mutationen eine Suppression des Phänotyps, der nach Überexpression von CapH2 in Speicheldrüsen erhalten wird. In einem reziproken Ansatz führten CapG-Mutationen zu einer Verstärkung des CapH2-mutanten Phänotyps in den Nährzellen von Ovarien. CapH2 und CapG scheinen also auf genetischer Ebene miteinander zu interagieren. Zusammengenommen legen die Ergebnisse ein Modell nahe, in dem CapG zwar nicht in direkter Assoziation mit Condensin II-spezifischen Komponenten vorliegt, aber parallel an der Strukturierung von Chromatin beteiligt ist und funktionell zum Teil mit den Aufgaben der Condensin II-spezifischen Komponenten überlappt.
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Two Irreducible Components of the Moduli Space M can 1,3
(2012)
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Yifan Chen
- This thesis is devoted to study two families of surfaces of general type: extended Burniat surfaces with K^2=3 and Keum-Naie-Mendes Lopes-Pardini surfaces. We focus on the corresponding subsets in the Gieseker moduli space. Extended Burniat surfaces with K^2=3 were constructed by Bauer and Catanese in the course of studying the tertiary Burniat surfaces and they showed that their closure is an irreducible component of the moduli space. We prove here the union of the loci described by them is indeed a full irreducible component. We also study the local deformations of two families of degenerations of the extended Burniat surfaces. Keum-Naie-Mendes Lopes-Pardini surfaces are the surfaces constructed by Mendes Lopes and Paridini, which realize the Keum-Naie surfaces with K^2=3 as degenerations. We reconstruct a subfamily of such surfaces and investigate their deformations. We show that the closure of the corresponding subset of the Keum-Naie-Mendes Lopes-Pardini surfaces is an irreducible component of the moduli space.
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Beiträge zur Optimalen Steuerung partiell-differential algebraischer Gleichungen
(2012)
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Armin Rund
- Diese Arbeit liefert Beiträge zur Optimalen Steuerung partiell-differential algebraischer Gleichungen. Insbesondere werden Zustandsbeschränkungen bei der Optimalen Steuerung gewöhnlicher und partieller Differentialgleichungen sowie gekoppelter Systeme untersucht. Die verschiedenen Konzepte dieser Gebiete werden verglichen, übertragen und eingeordnet. Zentrale Ergebnisse sind die Übertragung der notwendigen Bedingungen nach Bryson, Denham und Dreyfus auf elliptische Optimalsteuerungsprobleme mit punktweisen Zustandsbeschränkungen, die Übertragung von Sprungbedingungen und Maßdarstellungen auf ein ODE-PDE beschränktes Optimalsteuerungsproblem mit Zustandsbeschränkungen bei niederdimensionalen aktiven Mengen, sowie die Entwicklung effizienter numerischer Methoden für komplexe Anwendungsprobleme. Die Beiträge dieser Arbeit gliedern sich in vier Kapitel, deren Aspekte jeweils zusammengefasst werden: Zunächst werden die Grundlagen aus der Optimalen Steuerung gewöhnlicher Differentialgleichungen mit Zustandsbeschränkungen wiederholt. Die beiden geläufigen notwendigen Bedingungen nach Jacobson, Lele und Speyer, sowie nach Bryson, Denham und Dreyfus (BDD-Ansatz) werden erläutert und in den Zusammenhang der Optimalen Steuerung partieller Differentialgleichungen gestellt. Dabei wird der Zusammenhang zwischen den Sprungbedingungen und dem Borel-Maß hergestellt. In Kapitel 2 wird der BDD-Ansatz auf ein Optimalsteuerungsproblem einer elliptischen partiellen Differentialgleichung mit punktweisen Zustandsbeschränkungen und verteilten aktiven Mengen übertragen. Die Idee dieses BDD-Ansatzes ist es, die Zustandsbeschränkung auf der aktiven Menge äquivalent in eine Steuerungs-Zustandsbeschränkung oder ggf. eine reine Steuerungsbeschränkung zu transformieren. Dies erlaubt die Herleitung neuer notwendiger Bedingungen. Durch die Transformation der Zustandsbeschränkungen gewinnen die zugehörigen Lagrange-Multiplikatoren an Regularität. Man erhält aus den neuen notwendigen Bedingungen ein Randwertproblem auf verschiedenen Gebieten mit Übergangsbedingungen. Das Interface zwischen den verschiedenen Gebieten stellt eine Optimierungsvariable dar. Eine notwendige Bedingung am Interface wird mit Techniken der Shapeoptimierung hergeleitet. Das Kapitel 3 behandelt Zustandsbeschränkungen bei gemischten ODE-PDE Problemen: Anhand eines zeitabhängigen Anwendungsproblems - des sogenannten Rocketcars - lässt sich eine vollständige Darstellung des Borel-Maßes auf niederdimensionalen aktiven Mengen angeben. In der Folge lassen sich Sprungbedingungen und weitgehende Regularitätsaussagen herleiten. Die explizite Massdarstellung ermöglicht weiterhin die Formulierung als Mehrpunkt-Anfangsrandwertproblem und den Einsatz angepasster Lösungsmethoden. Kapitel 4 widmet sich schließlich einem komplexen Anwendungsproblem eines OC-PDAE: Ein Brennstoffzellenmodell stellt uns vor ein Optimalsteuerungsproblem eines Systems von partiell-differentiell algebraischen Gleichungen. Es werden notwendige Bedingungen hergeleitet und direkte sowie indirekte (adjungierten-basierte) Methoden der Optimalen Steuerung entwickelt und verglichen. Numerische Experimente bestätigen die Effizienz der vorgestellten Methoden. Insbesondere das indirekte Quasi-Newton-Verfahren erlaubt eine zeitadaptive optimale Steuerung der Brennstoffzellenanlage mit hoher Genauigkeit und unter geringer Rechenzeit.
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Effiziente parallele Implementierung eines expliziten Euler-Verfahrens für Grafikprozessoren durch Diamant-Tiling
(2012)
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Julien Kulbe
- Die hier vorliegende Arbeit beschäftigt sich damit, das explizite Euler-Verfahren auf Grafikprozessoren zu optimieren. Dabei werden die Speicherhierarchien, lokale Datenwiederverwendung, Ausnutzung der Speicherbandbreite der GPU und die Synchronisierung zwischen Host und Device genauer untersucht. Dabei werden zwei Implementierungen näher betrachtet, das Diamant-Tiling und das lineare Verfahren, da sie sich gut eignen um die Optimierungen genauer zu untersuchen. Es stellt sich dabei heraus, dass Optimierungen wie die lokale Datenwiederverwendung und der optimale Zugriff auf den Speicher sich gegensätzlich verhalten. Ein Mischverfahren (das Waben-Tiling), dass dabei die Vorteile des linearen Verfahrens und des Diamant-Tilings vereint, führt daher zu den besten Laufzeiten.
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Ein Rahmenwerk für das Prozessdesign zur Identifikation, Klassifikation und Umsetzung von Anforderungen - Dargestellt an der Konzeption des Prozesskonfigurators
(2012)
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Stephanie Meerkamm
- Prozessmanagement umfasst die Identifikation und Analyse der Unternehmensabläufe sowie deren Dokumentation und die Ausführung der Prozesse inklusive deren Steuerung. Dies sollte mit einer stetigen Verbesserung der Prozesse verbunden sein. Im Hinblick auf die konkrete Realisierung dieses Management-Ansatzes ist eine Fokussierung auf die Phase der Modellierung, welche die Identifikation sowie Dokumentation der Prozesse umfasst, zu beobachten. Dieser Phase geht das sog. Prozessdesign voraus. Auf Basis einer eingehenden Anforderungsanalyse erfolgt die Entwicklung und Evaluierung von Artefakten, wie zum Beispiel Konstrukte und/oder Methoden. Das vollständige Spektrum an Handlungsmöglichkeiten innerhalb des Prozessdesigns wird jedoch nur selten genutzt. Meist werden vorhandene (Standard-) Modellierungssprachen ausgewählt ohne diese in irgendeiner Art individuell zu gestalten. Dies wirkt sich oft negativ auf die Qualität der damit erstellten Prozessmodelle aus, aber auch auf die der Modellierung nachfolgenden Phasen des Management-Ansatzes wie Ausführung und Controlling. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein daher methodisches Rahmenwerk für das Prozessdesign entwickelt. Aufgrund der engen Kopplung an die nachfolgende Phase der Prozessmodellierung wird als Grundlage eine Meta-Modell-Hierarchie verwendet, die die Entwicklung, Anpassung sowie Definition von (Meta) Modellen vorsieht. Diese wurde explizit um eine Designkomponente inklusive der initialen Anforderungsanalyse erweitert. Damit liegt ein flexibles Vorgehensmodell für die Durchführung der Designphase vor, das dabei vor allem auch die Definition von Modellierungssprachen vorsieht. Das gesamte Rahmenwerk ist zudem nicht auf eine bestimmte Modellierungssprache oder Anwendungsdomäne der Prozesse ausgerichtet, sondern generisch konzipiert. Im zweiten Teil der Arbeit wird ein Anwendungsfall für das zuvor entwickelte Rahmenwerk vorgestellt. Aus der beispielhaft identifizierten Menge an Anforderungen wurde die des Managements variantenreicher Prozessmodelle ausgewählt und das Konzept eines Prozesskonfigurators entwickelt. Im Hinblick auf die Verwendung der variantenreichen Prozessmodelle wurde ein gestufter Konfigurationsprozess entwickelt. Dieser leitet den Anwender auf der einen Seite durch den Konfigurationsprozess, auf der anderen Seite wird ihm ein Höchstmaß an Freiheit gewährt, wann er welche variantenbezogene Entscheidung treffen möchte. Für die Darstellung der Varianten in einem Modell wurde ein bereits existierendes Konzept zur Abbildung variantenreicher Strukturen in Form des sog. mereologischen Graphen verwendet, das an die Eigenschaften von Prozessen angepasst wurde. Damit kann die gewünschte kompakte sowie strukturierte Modellierung der Varianten in einem Modell realisiert werden. Dieses Modellierungskonzept konnte als Prototyp in einem entsprechenden Modellierungswerkzeug implementiert werden.
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Molecular detection and identification of phytoplasmas in sugarcane in Hawaii, Thailand, Cuba and Near East
(2012)
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Ziad Soufi
- The Yellow leaf syndrome (YLS) had been first detected and described in Hawaiian sugarcane plantations. The polerovirus Sugarcane yellow leaf virus was identified as a causal agent of the syndrome; however there was no strict correlation between the degree of symptom expression and the virus titre. Therefore several surveys on breeding station sugarcane plants in Hawaiian Islands were done for Sugarcane yellow leaf phytoplasma (SCYLP), a bacterium which had been hypothesized to be also a causal agent of YLS. Two types of phytoplasmas were found in Hawaiian sugarcane cultivars mainly sugarcane white leaf phytoplasma (SCWL) which is a member in rice yellow dwarf group, in addition to aster yellows group. This was also true for sugarcane plants from Hawaiian plantations, which routinely use hot water-treatment for the seed cane cuttings. Sugarcane samples were obtained also from other countries including Cuba, Egypt, Syria and Thailand where sugarcane plants are also showing symptoms of yellowing or whiting. Aster yellows and X-disease phytoplasmas were found in Cuban cultivars whereas one sugarcane cultivar from Egypt contains grassy shoot phytoplasma that is a member in rice yellow dwarf group, but the other two Egyptian ones were phytoplasma-free. Syrian sugarcane was infected by phytoplasma that identified preliminary in rice yellow dwarf group. To our knowledge, this is the first report for the detection and identification of phytoplasma in sugarcane plants from Hawaii, Egypt and Syria. Our investigation on Thai sugarcane plants was in agreement with previous literature where sugarcane white leaf (SCWL) phytoplasma is associated with white leaf disease (Nakashima et al., 1994; Wongkaew et al., 1997). Q-PCR (real-time PCR) offers the opportunity to detect the phytoplasma in a sensitive, specific and quick manner, but that is not true for sugarcane plants with a very low titer of phytoplasma. Therefore, nested-PCR is better than qPCR for low titer phytoplasma detection and that is true for sugarcane yellow leaf phytoplasma disease. A BLAST search for the 16S rRNA gene sequences reported in this study showed that they shared 99 to 100% sequence identity with those of other phytoplasmas in the Aster yellows, X-disease and Rice yellow dwarf groups. However, no one of these identified strains can be described as a new “Candidatus Phytoplasma species”. On the other hand, Hawaiian sugarcane cultivar H78-7750 as a representative of Hawaiian breeding station sugarcane contains phytoplasma clustered to strain sugarcane white leaf (SCWL) phytoplasma, closely together with sugarcane white leaf phytoplasma from Taiwan (AY139874). It is possible to explain the occurrence of (SCWL) phytoplasma in Hawaiian Islands, by insect vectors or by infected stem cuttings which were obtained from other countries. Thai sugarcane contains phytoplasma isolate closely together with sugarcane white leaf phytoplasma from Myanmar. The transmission electron microscopic (TEM) studies revealed the presence of sugarcane white leaf phytoplasma only in phloem sieve tubes of diseased sugarcane leaves but not in adjacent cells to the sieve elements including companion cells and phloem parenchyma as well. According to ultrastructural observations under TEM, parenchymatic cells of bundle sheath and mesophyll tissue of affected leaves showed some alterations including accumulations of starch granules, increase plastoglobuli number and size in disorganized chloroplasts. Insect vectors of phytoplasmas are phloem feeders. Thus far, none of aphid species has been found to be a vector of phytoplasmas. Our tests showed also that black sugarcane aphids (Melanaphis Sacchari) were unable to transmit the phytoplasmas from infected sugarcane into the phytoplasma-free one. Hot water treatment has been proposed to cure plant material from phytoplasmas. Our tests showed that the appropriate hot water treatment, which recommended for phytoplasma elimination, is immersion of the sugarcane stem cuttings at 50°C for 60 min.
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Biochemical and structural characterization of Sirtuins from mammals and Thermotoga maritima
(2012)
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Mahadevan Lakshminarasimhan
- Sirtuins are NAD+ dependent protein deacetylases involved in regulation of metabolism, age related diseases and are suggested to mediate lifespan extending effects of calorie restriction. Mammals contain seven Sirtuin soforms with various cellular localizations and substrate preferences. This work focuses on the structural and biochemical characterization of several mammalian Sirtuin isoforms, with main emphasis on the largest member of the family, Sirt1.Analysis of various Sirt1 constructs using analytical ultracentrifugation and electron microscopy techniques identified it to be a monomer, similar to other mammalian isoforms. Comparison of activity between different Sirt1 constructs indicates that the termini might be involved in regulating the protein’s activity. It could be shown that the catalytic domain of Sirt1 is sufficient for its activation by the lifespan extending polyphenol resveratrol and that resveratrol can directly bind to Sirt1. Using a peptide array harboring all known mammalian acetylation sites several novel substrates for Sirt1 were identified and shown that resveratrol and other small molecules can modulate Sirt1 dependent deacetylation of substrate peptides and that the effect is specific for the sequence of the substrate site. This finding reveals exciting possibilities for the development of new modulators targeting only specific substrates of Sirt1. These compounds can further be used in analyzing the functions of Sirtuins in vivo and can also serve as attractive leads for developing Sirt1 specific drugs. Studies on the mitochondrial isoform Sirt3 revealed that Zinc is essential for the structural integrity of Sirtuins. Investigations on Sirt5, also a mitochondrial Sirtuin appears to indicate that it is insensitive to nicotinamide (a physiological inhibitor of Sirtuins). Studies on the nucleolar isoform Sirt7 identified Thr224 to be phosphorylated, and play a role in the enzyme’s activity. The thermotoga maritima Sirtuin Sir2Tm was used as a model system for structural characterization of Sirt1. The crystal structure of Sir2Tm in complex with Ex-527, a potent Sirt1 inhibitor was solved, which combined with biophysical studies offers information about Ex-527 binding and inhibition. Close contacts between Ex-527 and some form of ADP-ribose, possibly the product O-acetyl-ADP-ribose (which is not yet fully verified) in the closed enzyme conformation prevent the release of products, thereby stalling the enzymatic reaction. These results offer insights into the isoform specific inhibition of Sirtuins by Ex-527 and provide information for further improvement of Sirt1 specific inhibitors.
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Novel microemulsions with an anionic/non-ionic surfactant mixture
(2012)
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Lukas Wolf
- Mikroemulsionen bestehen im einfachsten Fall aus Wasser, Öl und Tensid(en). Es handelt sich dabei im Gegensatz zu normalen Emulsionen um transparente, thermodynamisch stabile Phasen. Diesen makroskopisch einphasig erscheinenden Systemen liegen jedoch hoch komplexe Nanostrukturen zu Grunde. Die in wissenschaftlicher Hinsicht bislang am besten untersuchten und verstandenen Mikroemulsionssysteme bestehen entweder aus Wasser, Öl und einem einzigen elektrisch ungeladenen nicht-ionischen Tensid oder einem elektrisch geladenen ionischen Tensid. Beide Systeme unterscheiden sich grundlegend, unter anderem in ihrem Phasenverhalten, ihrer Temperaturstabilität oder ihren Nanostrukturen. Systeme mit Mischungen aus ionischen und nichtionischen Tensiden dagegen wurden bisher kaum untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Phasenverhalten einer anionischen/nichtionischen Tensidmischung mit verschiedenen Ölen bei konstanter Temperatur und konstantem Tensidgehalt untersucht. Die Phasendiagramme weisen jeweils zwei optisch isotrope Phasengebiete, so genannte Einphasenkanäle, mit steigendem Öl-Gehalt auf. Die beiden Mikroemulsions-Einphasenkanäle sind voneinander durch ein optisch anisotropes Phasengebiet getrennt. Der Mikroemulsionskanal unterhalb des anisotropen Bereichs erstreckt sich von der wässrigen Phase ausgehend mit wachsendem Öl- und nichtionischen Co-Tensid-Anteil bis in die Mitte des Phasendiagramms und endet dort. Der obere Einphasenkanal verläuft durch ein steiles Minimum, in Bezug auf das Tensid/Co-Tensidverhältnis, durchgehend von der wässrigen zur ölreichen Seite des Phasendiagramms. Im Gegensatz zu Mikroemulsionen mit nichtionischen Tensiden handelt es sich um isotherme Einphasenkanäle. Die einphasigen Gebiete wurden mit diversen physikalisch-chemischen Methoden untersucht. Mittels Leitfähigkeits-, SANS-, PFG-NMR-Messungen und elektronenmikroskopischen cryo-TEM Aufnahmen konnten die Nanostrukturen identifiziert werden. Während im unteren Einphasenkanal die Strukturen aus kleinen Öl-Tröpfchen in einer kontinuierlichen Wasserphase bestehen, welche mit zunehmendem Öl-Gehalt anschwellen, kommt es im oberen Einphasenkanal zu einer komplexen Strukturänderung. Während der ölfreien Probe eine bikontinuierliche Schwammstruktur zu Grunde liegt, wandelt sich diese mit bereits wenigen Prozent an Öl zu einer polyedrischen Wasser-in-Öl Schaumstruktur. Für diese, in Mikroemulsionen bislang unbekannten, Struktur wurde der Begriff High Internal Phase Microemulsion (HIPME) eingeführt, aufgrund ihrer strukturellen Parallelen zu bereits bekannten High Internal Phase Emulsionen (HIPE). Mittels transienter Elektrodoppelbrechung konnte dieser komplexe strukturelle Übergang nachvollzogen werden. Die ermittelten strukturellen Relaxationszeiten, welche zudem die Viskosität der Mikroemulsionen bestimmen, weisen ein deutliches Maximum am Übergangspunkt von der bikontinuierlichen zur HIPME-Struktur auf. Grund für die beobachtete HIPME-Struktur ist vermutlich der Anteil der elektrischen Ladung des anionischen Tensids. Diese sorgt für eine vergleichbar hohe Grenzflächenspannung zwischen der wässrigen verdünnten Tensid-Phase und des Öls. Konsequenz dieser hohen Grenzflächenspannung sind ölkontinuierliche Schaumstrukturen anstatt bikontinuierlicher Strukturen, welche man in vergleichbaren Mikroemulsionen mit rein nichtionischen Tensiden erhält. Durch Abschirmen der elektrischen Ladungen mit Salz werden die HIPME-Strukturen gestört, was sich in einem Ansteigen der Leitfähigkeit und einer erhöhten Mobilität der Wasserphase äußert, welche mit NMR beobachtet wurde.
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Unique Emulsions based on recombinant Hydrophobins
(2012)
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Martin Reger
- Hydrophobins are very interesting proteins of fungal origin. Beside their relatively small size of around 100 amino acids, they are well known to be the most surface active, natural proteins that have a strong tendency for self-assembly. Due to their versatile properties hydrophobins are present in different fungal structures, like as coaters of hyphae. These diversified properties of hydrophobins raised great interest among scientists. Possible applications in surface modification or emulsion industry were always restricted by the cost and effort of natural hydrophobin purification. This changed dramatically by the use of white biotechnology resulting in the availability of high amounts of recombinant hydrophobins nowadays. This study started with the physicochemical characterization of two recombinant hydrophobins, called H Star Proteins ® A and B. Both show a remarkable, time-dependent surface activity as well as a distinct aggregation behaviour indicating them to have the typical properties of natural hydrophobins. The use of the recombinant hydrophobins as emulsifier resulted in the formation of gel-like oil in water emulsions. Interestingly, without the occurrence of typical emulsion instability processes like creaming or coalescence, these emulsions showed significant aging effects. We conclude them to be the consequence of the time-dependent formation and progression of a self-supporting, three-dimensional protein network that evolves in the emulsion. The self-assemble tendency of recombinant hydrophobins is clearly not limited by adsorption to the oil-water interface. Obviously the long term stability of the emulsion is determined by the sticky character of the hydrophobin coated oil droplets that attract each other in the short range distance. This type of emulsion stabilization mechanism is absolutely novel in the field of emulsion technology. Moreover we used the hydrophobins’ ability of surface modification in order to coat disk-like clay particles. These clay-hydrophobin sandwiches were used for the formation of Pickering Emulsions. It turned out that the synergistic use of clay and hydrophobin resulted in homogenous, long-term stable and tooth-paste like emulsions. The clay particles improved strikingly the rigidity and elasticity of the self-supporting hydrophobin network. Substitution of the clay particles by boehmite needles resulted in similar Pickering emulsions. Finally, we report that it is possible to replace hydrophobin in combination with clay by other proteins, amphiphiles or surfactants. By adjusting the preparation conditions, the emulsifier concentration or the oil mass fraction one has a versatile tool to obtain Pickering emulsions with the desired properties. A new stabilization mechanism in emulsion science is introduced, supported and confirmed by our results.
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Identification of substrate proteins of FtsH during sporulation of Bacillus subtilis
(2012)
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Hue Bach Thi Nguyen
- FtsH is an ATP- and Zn2+-dependent metalloprotease anchored in the cytoplasmic membrane by two transmembrane segments. It is the unique membrane-bound AAA-protease in bacteria that performs a variety of regulatory functions. In B. subtilis, an ftsH knockout exhibits a pleiotropic phenotype such as filamentous growth, sensitivity towards heat, osmotic shock and cells are unable to sporulate. Recently, it has been shown that ftsH knockout cells fail to entry sporulation stage II due to lack of a sufficient amount of Spo0A~P and the first substrate of FtsH identified in B. subtilis is the Spo0E phosphatase, a negative regulator that dephosphorylates Spo0A~P. However, the sporulation frequency in a spo0E ftsH double mutant strain was only partly restored, we hypothesized that FtsH might degrade additional substrate proteins involved in sporulation. To identify these proteins, two different strategies were applied. By using the 2D gel technique, the proteomes of an ftsH wild-type strain was compared with an ftsH null mutant. Several proteins were identified to be either up- or down-regulated in the absence of FtsH. One of them up-regulated about 4-fold was identified as Spo0M. Since ftsH did not interfere with transcription of spo0M, an in vitro proteolysis assay was established using purified components. It was shown that Spo0M was degraded by FtsH in an ATP- and time-dependent way. In the second strategy, an ftsHtrap mutant was constructed and tested for loss of its proteolytic activity. Protease trap mutants are still able to bind substrate proteins, but are unable to degrade them. By using FtsHtrap fused to a GST-tag, YwnF, a membrane protein, was trapped and identified as a substrate of FtsH by mass spectrometry. However, further experiments will be required to confirm YwnF as a target of FtsH. The last part of this thesis was focused on the eag gene, which forms a bicistronic operon with Spo0E. Construction and analysis of an eag insertion mutant exhibited a slight increase in the sporulation frequency and in the amount of Spo0A. A transcriptional fusion between the promoter of the spo0E-eag operon and the lacZ reporter gene revealed an increase in the beta-galactosidase activity from t0 when the cells were grown in sporulation medium. Since the Eag protein may be an integral membrane protein, it may bind excess Spo0E thereby preventing it from dephosphorylating Spo0A~P. Alternatively, Eag may bind Spo0E and present it as a modulator to FtsH for degradation.
