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Etablierung von Methoden zur Bioevaluation antitumoraler Naturstoffe, Metabolite und Analoga (2011)

Sebastian Knauer

Die Ziele, die ich mir vor Beginn meiner Arbeit gesteckt habe (siehe 1.3), wurden weitestgehend erreicht. Es wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe Illudin M 11 zuverlässig gewonnen werden kann. Die Aufzucht von O. olearius im Medium HA- und die Extraktion nach Kutscher-Steudel erwiesen sich hierbei als Methoden der Wahl. Illudin S 11a konnte jedoch nicht isoliert werden. Daneben konnte eine Reihe von Verfahren zur Evaluierung von Testsubstanzen etabliert werden. Die Untersuchungen der Substanzeigenschaften (siehe 2.5 bis 2.8) lieferten nützliche und verlässliche Ergebnisse, auch wenn man hinsichtlich des Einsatzbereiches manchmal Einschränkungen in Kauf nehmen musste. Die Stabilität von Esterbindungen wurde auf zwei Arten untersucht. Die getesteten Substanzen 16c, 18 und 19b erwiesen sich hierbei als weitestgehend stabil gegenüber Hydrolyse (siehe 3.2). Die Methode, die zur Untersuchung der Komplexbildung eingesetzt wurde, lässt sich nicht auf alle Verbindungen übertragen, sondern nur auf solche, deren Komplexe ein Absorptionsmaximum im sichtbaren Bereich besitzen (siehe 3.3). Bei den Eisenkomplexen war das Potential der getesteten Liganden, Komplexe zu bilden vergleichbar mit dem von EDTA. Bei den anderen getesteten Kationen war dieses schwächer ausgeprägt. Im Rahmen des Glutathion-Monitorings wurde festgestellt, dass – im Gegensatz zur Muttersubstanz 11 – keines der getesteten Illudinderivate 27 eine spontane Reaktion mit GSH eingeht (siehe 3.4). Der Alkylierungsassay mit Aceton liefert nur für farblose Verbindungen verlässliche Ergebnisse. Bei den getesteten Illudinderivaten 27 konnte zwar ein Alkylierungspotential gemessen werden, doch stellt deren vorhandene Eigenabsorption einen gewissen Unsicherheitsfaktor dar. Der Alkylierungsassay mit Acetophenon lieferte keine verwertbaren Ergebnisse (siehe 3.5). Die zellbasierten Analysen (siehe 2.9 bis 2.11) sowie der CAM-Assay (siehe 2.12) sind für alle Stoffe durchführbar. Auch wenn die untersuchten Organismen (Zellen und Embryonen) nicht immer auf die gleiche Weise reagieren, kommen auch hierbei verlässliche Resultate zu Stande. Da die Zahl der durchführbaren Tests durch Kosten und Verfügbarkeit der Untersuchungsobjekte limitiert ist, wurde hinsichtlich der Testsubstanzen immer eine Vorauswahl getroffen. Beim TUNEL-Test zeigten die meisten Verbindungen ein proapoptotisches Verhalten, besonders gut wirkten die Illudinderivate 27 (siehe 3.6). Der Annexin-Test ist nur bedingt aussagekräftig. Er ließ sich zum einen nur mit Suspensionszellen durchführen, zum anderen war es manchmal kaum möglich, spätapoptotische von nekrotischen Zellen zu unterscheiden (siehe 3.7). Mit Hilfe von Immunoblots wollte man Rückschlüsse hinsichtlich des Mechanismus der Apoptoseinitiierung ziehen. Die schnelle Prozessierung der Caspase 9 legt den Schluß nahe, dass die Platinkomplexkonjugate 13 (HL 60), die Oxazole 26 (Kb-V1), die Illudinderivate 27 (HL 60 und 518 A2) und die Chalkone 20, 21a und 21c (HL 60) zu einer Aktivierung über den mitochondrialen Weg führen. Die anderen Testverbindungen bedürfen weiterer Untersuchungen in Bezug auf den Signalweg der Apoptoseinitiierung (siehe 3.8). Einige Derivate der antivaskulären Verbindung Combretastatin A-4 7a wurden mit Hilfe des CAM-Assays untersucht. Die meisten zeigten hierbei erwartungsgemäß ein vergleichbares Verhalten. Besonders interessant ist der Aktivitätsunterschied der Combretastatin-Analoga 26h und 26i. Dieser wurde sowohl beim TUNEL-Test als auch beim CAM-Assay beobachtet, obwohl sich beide Verbindungen strukturell kaum unterscheiden.

Von partikulären Bausteinen zu suprakolloidalen Strukturen finiter Größe (2011)

Claudia Simone Wagner

Im Rahmen dieser Arbeit wurden unter Zuhilfenahme von Templaten komplexe kolloidale Strukturen aufgebaut. Die Herstellung von kolloidalen Clustern, Hybridclustern und nanoporösen Kapseln wurde in Verknüpfung mit theoretischer Modellierung erforscht, um komplexe Bausteine für die Mesotechnologie zur Verfügung zu stellen. Zu diesem Zweck wurden gezielt größere Mengen kolloidaler Cluster hergestellt, wobei erstmals eine Gesamtgröße der Aggregate unter 300 nm erzielt werden konnte. Cluster dieser Größe sind auf Grund der Brownschen Teilchenbewegung stabilisiert, welche der Sedimentation der Cluster entgegenwirkt. Die Clusterherstellung erfolgte durch eine kontrollierte Aggregation kolloidaler Polymer-Bausteine. Dabei wurden Emulsionströpfchen von Öl-in-Wasser-Emulsionen als Template verwendet. Die in derartigen Emulsionen dispergierten Partikel adsorbierten auf Grund des Pickering-Effekts an der Tröpfchenoberfläche. Die Reduktion der Clustergröße wurde durch eine Beschränkung der Primärbausteine auf Polystyrol-Partikel auf Durchmesser kleiner 200 nm und eng verteilte Öltröpfchen im Mikrometerbereich erreicht. Die Tröpfchengrößenverteilung konnte gezielt durch den Einsatz von Ultraschall gesteuert werden. Durch kontrolliertes Verdampfen der Öltröpfchen wurde die Clusterbildung induziert und es kam zu einer Anordnung der Partikel zu Clustern mit definierten Konfigurationen. Durch Zentrifugation in einem Dichtegradienten ließ sich die Suspension in Fraktionen einheitlicher Cluster auftrennen und schließlich mittels rasterelektronischer Aufnahmen definierten Konfigurationen zuordnen. Um in der vorliegenden Dissertation das nächsthöhere Level an Komplexität zu erreichen, wurde das neue Verfahren der Clusterherstellung zur Synthese definierter kolloidaler Hybridcluster eingesetzt, das heißt zum Aufbau von Clustern bestehend aus unterschiedlichen Bausteinen. Zunächst wurden Polystyrol-Cluster nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Diese dienten als Template für eine Adsorption entgegengesetzt geladener anorganischer Nanopartikel auf ihren Oberflächen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass ein hoher Bedeckungsgrad der Clusteroberfläche mit Nanopartikeln mit einer Ladungsumkehr verbunden ist und dies die Herstellung stabiler Suspensionen von Hybridclustern ermöglicht, obwohl sich die Polystyrol-Cluster und die Nanopartikel in ihrer Nettoladung unterschieden. Die Charakterisierung der Hybridcluster durch Rasterelektronenmikroskopie ergab, dass das Abscheiden der Nanopartikel zu einer gleichmäßigen, räumlich separierten Verteilung der Nanopartikel auf der Clusteroberfläche führte. Somit eröffnen sich Perspektiven für Hybride mit einer Kontrolle über Form, Zusammensetzung und Oberflächenrauigkeit. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit einer Strategie zur Herstellung anisometrischer, nanoporöser Kapseln, sogenannten Nanosomen, bestehend aus einer geschlossenen Monolage von Nanopartikeln. Zur Synthese der Nanosome wurden die Erkenntnisse aus den vorangegangenen Arbeiten genutzt: zum einen können geladene Partikel kontrolliert über die Öl- und die Wasserphase in den Emulsionsschritt eingebracht werden und zum anderen können kolloidale Cluster als Template zur Herstellung von Hybriden dienen. Zuerst wurden negativ geladene anorganische Nanopartikel und positiv geladene Polymerpartikel an der Oberfläche von Emulsionströpfchen vereint. Die Emulgierung erfolgte in Anlehnung an das Verfahren zur Herstellung von kolloidalen Clustern. Die entstandenen Heteroaggregate wurden anschließend mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Dabei zeigte sich, dass diese eine Kern-Schale-Architektur besaßen, wobei definierte Polymercluster als Kern fungierten und die Nanopartikel die Schale bildeten. Eine anschließende Entfernung der inneren Template durch Pyrolyse zeigte nanoporöse Kapseln mit komplexer Gestalt, welche durch die Anzahl der Polymerpartikel pro Tröpfchen bestimmt war. Trotz der Monolage der erhaltenen Nanosome waren alle untersuchten Konfigurationen intakt. Zusätzliche theoretische Modellierung erlaubte ein vertieftes Verständnis der Anordnung der Nanopartikel auf den Clustern und eine Aussage zur Stabilität der Nanosome. Durch deren Komplexität und einer bemerkenswert hohen Dichte an Nanoporen könnten die Nanosome somit Anwendung im Bereich der Biomedizin finden. Zusammenfassend dargestellt präsentiert diese Dissertation die Kombination elementarer Bausteine zu mesoskopischen Designer-Aggregaten höherer Komplexität, gepaart mit einzigartigen optischen und magnetischen Eigenschaften.

Biphasic, Homogeneous, and Heterogeneous Hydrocarbon Conversion Reactions with Novel Aluminum Chloride Based Catalyst Systems (2011)

Matthias Dötterl

The aim of this thesis was the development of novel cocatalysts for nickel catalyzed olefin dimerization and oligomerization reactions. For this purpose, cheap and air stable Lewis acidic chloroaluminate ionic liquids were the starting point for our investigations. Chloroaluminate melts are immiscible with hydrocarbon phases, and thus, biphasic oligomerization reactions allow a simple product separation by decantation. Unmodified chloroaluminate melts containing excess aluminum chloride predominantly catalyze non selective, cationic olefin oligomerization reactions. We found that the addition of triphenylamine, triphenylphosphine, or triphenylbismuth donors efficiently suppressed these side reactions to yield an ideal cheap and air stable ionic liquid cocatalyst for common nickel complexes used for olefin dimerization reactions. Especially triphenylbismuth was able to buffer slightly acidic chloroaluminate melts as well as highly acidic compositions. For nickel catalyzed dimerization reactions, we found that high buffering levels led to very high selectivities to give dimers, while systems with lower buffer contents were less selective but extremely active. Further, the melting points of acidic chloroaluminate melts were reduced upon addition of BiPh3. Thus, room temperature ionic liquid compositions derived from 100 different organic halide salts were screened towards their performances in nickel catalyzed selective propene dimerization reactions. Amines and BiPh3 used for such systems can be easily recovered by acid base extraction. Subsequently, an optimized composition was successfully employed to dimerize ethene, propene, 1-butene, and 1-hexene with high activities and selectivities. In order to minimize leaching effects and to investigate the interactions of a donor additive with the ionic liquid, a cationic para-trimethylammonium substituted triphenylphosphine derivative was synthesized and its interaction with the ionic liquid was monitored by means of 31P NMR spectroscopy. The concept of buffering highly Lewis acidic aluminum chloride centers was also transferred to binary homogeneous systems. In combination with stoichiometric amounts of BiPh3 or N-methylpyrrole buffer, aluminum chloride readily dissolved in toluene and methylene chloride to form a highly efficient, cheap and air stable cocatalyst for nickel catalyst precursors. Furthermore, the Lewis acidities of these binary homogeneous cocatalyst solutions could be tuned precisely by the choice of the solvent and the type and amount of buffer. Also, buffer addition efficiently suppressed isomerization reactions of the 1-olefinic products. The interaction of BiPh3 and N-methylpyrrole with AlCl3 was monitored by 27Al NMR spectroscopy. Further, the concept of buffering highly Lewis acidic aluminum species was extended to heterogeneous systems. The Lewis acidities of EtAlCl2 or Et2AlCl modified silicas were reduced by the addition of BiPh3 or N-methylpyrrole buffers. Buffered surface modified silica cocatalysts were successfully employed to activate nickel complexes for highly selective olefin dimerization reactions. Also, surface modified silica proved to be an ideal substrate for the formation of supported ionic liquid phase (SILP) cocatalyst systems used in nickel catalyzed olefin dimerization reactions. Buffered aluminum based cocatalysts were also able to activate a nickel diimine complex for biphasic, homogeneous, and heterogeneous ethene polymerization reactions. The polymer yields, molecular weights and polydispersities of the polyethylenes could be influenced by varying the solvent or the type and amount of buffer. We developed the first air stable cocatalyst systems solely based on aluminum chloride. With the right combination of solvent, type and amount of buffer, and process parameters, tailor-made homogeneous, heterogeneous and biphasic cocatalysts for numerous catalyst precursors can be designed. The systems proved to be highly active, long term stable and very selective for olefin dimerization or polymerization reactions. Due to the cheap components and the possibility to recycle buffers or halide salts, these new systems provide promising alternatives to established alkylaluminum based cocatalyst systems.

Composites of Spherical Polyelectrolyte Brushes and Nanoparticles – Synthesis, Characterization and Their Use in Catalysis (2011)

Frank Polzer

The main objective of this thesis was the synthesis of colloidal stable managanese oxide nanoparticles (MnOxNP) for applications as a catalyst in aqueous solution. Spherical polyelectrolyte brushes (SPBs) with poly(2-trimethyl ammonium ethyl methacrylate chloride) (pTMAEMC) chains were used as support particles to stabilize the MnOxNP by immobilization. In a first step we established and investigated the method of the in situ generation of the MnOxNP within SPBs. It was found that no reducing agent is needed for the reduction of the permanganate precursors and that they do not react with the cationic polymer chains of the SPBs. By a combination of powder X-ray diffraction (PXRD), transmission electron microscopy (TEM) and cryogenic TEM (cryoTEM) it was found that the platelet-like MnOxNP are of layered topology built up from MnO6 octahedra denoted as birnessite. The PXRD patterns revealed a disorder along the stacking direction of the single layers of hexagonal sheets. Furthermore, the structure of the composite material observed by TEM strongly differs compared to that in cryoTEM micrographs. The composite material was furthermore analyzed by high resolution TEM (HRTEM) and X-ray absorption fine structure (XAFS) analysis. The qualitative X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis using reference compounds confirmed the crystallographic similarity of the MnOxNP to a c-disordered birnessite. The local structure of the MnOxNP was investigated by a quantitative extended X-ray absorption fine structure (EXAFS) analysis that revealed that no significant difference between the MnOxNP@SPB in aqueous solution and in the dried state. In general, the hexagonal sheets of edge-share MnO6 octahedra are compressed along the c-direction, that is, along the stacking direction. Additionally, a new kind of composite material composed of star-shaped pTMAEMC homopolymer and MnOxNP was synthesized and characterized To test the MnOxNP@SPB composite material for its catalytic activity, the oxidation of morin by hydrogen peroxide was established as a model reaction. It could be shown by UV/vis measurements that the rate of the decomposition is highly depending on the ratio between morin and the oxidant H2O2. This finding was modeled by a Langmuir-Hinshelwood reaction mechanism. The study proved the potential application of the composite material as a catalyst especially for water-based catalysis. Furthermore, a detailed kinetic analysis of the reduction of 4-nitrophenol by sodium borohydride using gold and platinum nanoparticles immobilized on SPBs has been conducted. In analogy to the work on the oxidative decomposition of morin, a Langmuir-Hinshelwood model was used for the description of the reaction mechanism. Using this model, the adsorption constants for both reactants as well as the rate constant of the surface reaction could be determined for both noble metal nanoparticles. This showed that the higher catalytic activity of Pt is mainly due to the higher rate constant of the surface reaction. Additionally, the induction period of the reduction of 4-nitrophenol could be assigned to a surface reconstructuring of the nanoparticles due to the adsorption of 4-nitrophenol. Finally, the synthesis of a novel zwitterionic SPB could be realized using aqueous atom transfer radical polymerization. These particles show a surprisingly high colloidal stability in aqueous medium though the poly(2-(methacryloyloxy)ethyl dimethyl-(3-sulfopropyl)ammonium hydroxide) (pMEDSAH) chains are not soluble in pure water. The solution behavior in water was furthermore studied by dynamic light scattering, TEM and cryoTEM proving the collapsed state of the brush layer. The zwitterionic shell undergoes an internal phase separation leading to a surface-near layer whereas only a minor part of the chains reaches further out into the solution. The collapse was explained by the formation of aggregates of monomer units by zwitterionic or hydrophobic interactions. It was shown that the zwitterionic shell swells upon the addition of high amounts of salts and/or upon increasing the temperature due to the presence of an upper critical solution temperature. In conclusion, this thesis presented a new method for the generation and stabilization of MnOxNP of layered topology using cationic SPBs. The mechanism of the in situ generation could be elucidated as well as the microscopic structure of the composite material in the aqueous dispersed state. Using state of the art characterization methods like XAFS, the local environment of the MnOxNP around the Mn absorber could be determined. The catalytic activity of the MnOxNP was studied in detail applying a Langmuir-Hinshelwood model to the catalytic degradation of morin. A similar study gave new insights into the reduction of 4-nitrophenol using noble metal nanoparticles applying a similar model. The synthesis and analysis of zwitterionic SPBs gave important information about their solution behavior.

Chain-Growth Polymerization of 3-Hexylthiophene Towards Well-Defined Semiconductor Block Copolymers (2011)

Ruth Lohwasser

The central point of this thesis is the control of the P3HT synthesis using Kumada catalyst transfer polymerization (KCTP). Kinetic studies of the active monomer formation via Grignard metathesis revealed that this reaction is rather slow, however, its completion is essential for controlled end groups. It was shown that LiCl accelerates this reaction and allows 100% H/Br end groups without long reaction times. MeOH as a quenching reagent was found to cause chain-chain coupling via disproportionation of the Ni-catalyst species. For non-functionalized P3HTs HCl was identified as the best quenching agent. The identification of these factors now allows the fast synthesis of any molecular weight with 100% homogeneous functionalizable H/Br end groups. In the second part these well-defined P3HTs were used to investigate their equilibrium bulk structures and aggregation in solution. A temperature dependent phase diagram of the crystalline regions in P3HT was obtained in bulk. Further, the order of the P3HT side chains was elucidated for the first time as tilted and non-interdigitated. The analysis of the semicrystalline order of P3HT showed extended chain crystals as the equilibrium structures up to a molecular weight of ~20 kDa. The study of the aggregate formation in solution revealed that the amount of aggregates and their nature depends on the used solvent, the molecular weight and the synthetic method. The maximum fraction of aggregates in solution seemed to indicate the resulting charge carrier mobility measured in organic thin film field effect transistors. For the well-defined P3HTs, even low molecular weight samples allow for high charge carrier mobility. In the third part the bromine end groups were used to introduce valuable carboxylic end groups in one single, selective and quantitative post-polymerization step. Thus, carboxylated polymers with a charge carrier mobility as high as 10 3 cm2/Vs were obtained. These functionalized polymers can be anchored onto surfaces, can coordinate nanoparticles or can be used as end cappers for the formation of block copolymers. Additionally, a correlation of the melting enthalpies with the charge carrier mobilities indicated that the crystallinity is the determinant factor for the molecular weight dependence of the charge carrier mobility. A great challenge for the synthesis of P3HT containing block copolymers is to combine KCTP with other controlled polymerization methods. Especially conjugated blocks with high molecular weights are difficult to incorporate, because of their lower solubility and lower percentage of end groups. Here, it was demonstrated that copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition, a so-called click reaction, is a simple and efficient approach to create high molecular weight P3HT macroinitiators for nitroxide mediated radical polymerization. First, the synthesis of alkyne functionalized P3HT was optimized. HCl as a quenching reagent caused hydrohalogenation and hydration reactions and MeOH proved to be the quenching reagent of choice. In the second step, P3HT-alkyne was combined with an azide functionalized alkoxyamine to form the macroinitiator in one single post-polymerization step. Two different types of block copolymers were realized. The first type is amphiphilic P3HT-b-P4VP with a polar coil block, which is able to coordinate to inorganic particles. Thermal analysis showed that the crystallite size of P3HT is hardly influenced by the coil content when such long P3HT rod blocks are used. Preliminary investigations of the self-assembly in solution, demonstrated that colloidal structures with crystalline P3HT cores are obtained in P4VP selective solvents. Thus, P3HT b P4VP is an interesting system for hybrid photovoltaics and for investigating structure formation of rod-coil block copolymers in bulk and solution. The second type of block copolymers are fully-functionalized P3HT-b-PPerAcrs, with PPerAcr as an electron conducting second block. With the new synthetic approach it was possible to get an exclusively P3HT-b-PPerAcr diblock copolymer with a high molecular weight. In this context a high content of PPerAcr of 64wt% was realized which is important for a balanced charge transport in OPVs. The pure diblock, the high molecular weight and, hence, a high chiN parameter enabled for the first time the formation of a hexagonally ordered cylindrical bulk structure for a fully-functionalized crystalline-crystalline block copolymer. Additionally, in thin films, order-disorder transition and microphase separation was observed with domain sizes in the range of the exciton diffusion length. In conclusion, the optimization of the synthesis of P3HT allowed a better understanding of fundamental aspects about its molecular weight dependent structures and the resulting properties. Further, new end groups could be introduced to widen its applications. Additionally, long P3HT blocks were efficiently incorporated into well-defined diblock copolymers.

Strukturelle Untersuchungen an dem Radikalenzym (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase (2011)

Stefan Knauer

In der Natur werden viele chemisch schwierige Reaktionen von Radikalenzymen katalysiert. Die (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase katalysiert die Dehydratisierung von (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA in der Fermentation von L-Leucin im humanpathogenen Bakterium Clostridium difficile. Im Gegensatz zu einer Vielzahl von Radikalenzymen, wie beispielsweise der Coenzym B12-abhängigen bakteriellen Klasse II Ribonukleotid-Reduktase oder der S-Adenosylmethionin-abhängigen Biotin-Synthase, benötigt die (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase keine komplexen Kofaktoren zur Erzeugung des katalytisch aktiven Radikals. Stattdessen verwendet sie ein einzelnes, hoch energetisches Elektron. Bei der Dehydratisierung – einer atypischen α/β-Eliminierung – werden reduktiv Ketylradikale im Substrat erzeugt. Die Dehydratase muss zunächst aktiviert werden, indem ein Aktivator, der ein [4Fe-4S]-Zentrum enthält, unter ATP-Hydrolyse ein Elektron auf die Dehydratase überträgt. Für den Aktivator werden im Laufe des Aktivierungsprozesses Nukleotid- und redox-abhängige Konformationsänderungen angenommen. Das hoch reaktive Elektron wird nach jedem Substratumsatz wieder auf die Dehydratase übertragen, so dass bis zu 10.000 Umsätze katalysiert werden können, bevor eine erneute Aktivierung notwendig ist. Die strukturelle Grundlage der Aktivierung sowie die Art und Weise, wie das aktive Elektron in der Dehydratase nach erfolgtem Umsatz wiedergewonnen und vor Verlust durch unspezifische Nebenreaktionen geschützt wird, ist unbekannt. In dieser Arbeit konnte zunächst die Struktur der homodimeren (E)-2-Isocaprenoyl-CoA:2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase gelöst werden, die in der Fermentation von L-Leucin den zweimaligen Transfer eines Coenzym A-Moleküls katalysiert. Sie gehört zur Familie III der CoA-Transferasen und besitzt deren typische Faltung. Ein Aspartatrest im aktiven Zentrum ist wahrscheinlich an der Ausbildung von kovalenten Intermediaten beteiligt. Es wurden die Strukturen des reduzierten Aktivators ohne Nukleotid, mit ADP und mit dem ATP-Analogon ADPNP bestimmt. Der homodimere Aktivator gehört zur Actin-Faltungsfamilie und die Monomere sind durch ein verbrückendes [4Fe-4S]-Zentrum miteinander verbunden. Jedes Monomer besteht aus zwei Domänen, die in Abwesenheit eines Nukleotids eine offene und in Gegenwart eines Nukleotids eine geschlossene Konformation einnehmen. Die Strukturen des reduzierten Aktivators mit gebundenem ADP und ADPNP zeigten keine signifikaten Konformationsunterschiede. Der Vergleich mit der Struktur eines oxidierten Aktivators ergab, dass auch die Reduktion des [4Fe-4S]-Zentrums offenbar keine strukturellen Änderungen zur Folge hat. Möglicherweise spiegeln die Strukturen, die alle mittels Röntgenkristallographie bestimmt wurden, jedoch nicht die konformationelle Flexibilität in Lösung wider. Erstmals wurde die Komplexbildung zwischen dem Aktivator und der Dehydratase mittels ADPNP nachgewiesen. Die Strukturen des Aktivators legen nahe, dass die Komplexildung über den Prozess der konformationellen Selektion geschieht. Die Struktur der Dehydratase zeigte, dass das heterodimere Protein zwei [4Fe-4S]-Zentren in einem Abstand von 12 Å beinhaltet. Jedes Fe/S-Zetrum ist von drei Cysteinresten und einem terminalen Liganden koordiniert. Das Fe/S-Zentrum in der α-Untereinheit ist Teil des aktiven Zentrums und besitzt in Abwesenheit von Substrat ein Hydroxyidion/Wassermolekül als vierten Liganden. Das Substrat ersetzt diesen Liganden und koordiniert das Fe/S-Zentrum mit dem Carbonylsauerstoffatom der Thioestergruppe. Das [4Fe-4S]-Zentrum in der β-Untereinheit hat eine Sulfhydryl-/Sulfidogruppe als terminalen Liganden und fungiert als Speicher für das Elektron, wenn kein Substrat anwesend ist. Die Struktur der (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase dient als Modell für die Familie der 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen und der Gruppe der phylogenetisch verwandten Benzoyl-CoA-Reduktasen.

Isolierung, Strukturaufklärung und Totalsynthese von Alkaloiden aus Stenus Käfern und der Seeanemone Heteractis aurora (2011)

Tobias Müller

Die neuen Pyridinalkaloide (Z)- und (E)-3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin konnten jeweils in den Pygidialdrüsen der Kurzflügelkäfer Stenus solutus und S. similis als Hauptkomponenten nachgewiesen werden. Die Norverbindung 3-(1-Isobutenyl)-pyridin wurde als Minderkomponente in S. solutus, S. cicindeloides, S. binotatus und S. pubescens gefunden. Die Strukturen wurden durch NMR-Spektroskopie und Vergleich mit synthetischen Referenzen aufgeklärt. Die Pyridine wurden durch Umsetzung von Nicotinaldehyd mit dem jeweiligen Phosphoniumsalz nach WITTIG in einer Stufe erhalten. Für das bekannte Spreitungs- und Abwehralkaloid Stenusin, welches in den meisten Käfern der Gattung Stenus vorkommt, wurde eine neuartige Syntheseroute entwickelt. Die Stenusin enthaltenden Steninae zeigen eine charakteristische Zusammensetzung aller vier Stereoisomeren. Alle bislang bekannten stereoselektiven Zugänge zu Stenusin, wie auch die auf der SAMP/RAMP-Methode basierende Varinate nach ENDERS et al., erlauben nur die Darstellung der in der Seitenkette (S)-konfigurierten Alkaloide (2S,3R)- und (2S,3S)-Stenusin. Daher wurde eine neue Synthese entwickelt, die es erlaubt, alle Isomere selektiv darzustellen. Das Stereozentrum im Piperidinring wird durch auxiliarvermittelte asymmetrische Hydrierung erzeugt, während die Seitenkette entweder aus dem chiralen Pool ((S)-2-Methylbutanol) entnommen wird – identisch mit der Variante nach ENDERS – oder mittels einer chemoenzymatischen Synthese erzeugt wird. Insbesondere die (2S,3R)- und (2S,3S)-Isomere lassen sich ausgehend von 3-Brompyridin und (S)-2-Methylbutylbromid in einer sehr kurzen Sequenz von nur 4 Stufen in guter Ausbeute darstellen. Weiterhin erfolgt die gesamte Synthese frei von Schutzgruppen. Das verwendete EVANS-Auxiliar kann nach der Hydrierung unverändert wiedergewonnen werden. Das neue Alkaloid Cicindeloin wurde aus Stenus-Käfern der Art S. cicindeloides isoliert und dessen Struktur durch NMR-Spektroskopie in Verbindung mit EI- und ESI-Massenspektroskopie aufgeklärt. Die Absolutkonfiguration von Cicindeloin konnte durch stereoselektive Totalsynthese und GC-Vergleich mit dem Naturstoff an einer chiralen Phase bestimmt werden. Es wurde ein totalsynthetischer Zugang mit 20% Gesamt¬ausbeute entwickelt, der eine lineare Sequenz von 12 Stufen umfasst, von denen neun ohne Chromatographie auskommen.

Fabrication of Polymersomes using Microfluidic Devices (2011)

Julian Thiele

The fabrication of diblock copolymer vesicles, so-called polymersomes, from poly(2-vinylpyridine)-block-poly(ethylene glycol) (P2VP-b-PEG) and poly(ethylene glycol)-block-poly(lactid acid) (PEG-b-PLA) by means of microfluidics is described. The experiments were performed in microfluidic devices made by soft lithography in poly(dimethylsiloxane) (PDMS). To gain insight into the fluid dynamics in the microfluidic devices, 2D and 3D simulations based on the finite element method (FEM) were performed. This allowed for optimization of the microchannel geometry, and thus precise control over the formation process and properties of the polymersomes, which were extensively characterized by dynamic light scattering (DLS), confocal laser scanning microscopy (CLSM) and cryo transmission electron microscopy (cryo-TEM). Two distinct approaches to control the vesicular self-assembly of copolymer molecules into polymersomes were studied: the undirected self-assembly using hydrodynamic flow focusing (HFF) and the directed self-assembly using copolymer-stabilized water/organic solvent/water (W/O/W) double emulsion templates. In the former case, the formation of polymersomes occurred at the interface of a flow-focused, copolymer-loaded solvent stream and a selective solvent in a simple microchannel cross junction. Investigations revealed that the polymersome size is in proportion with the flow rate ratio of polymer solution and the selective solvent; a nucleation and growth model explaining the observed relation between flow conditions and polymersome size was proposed. In the latter case, the formation of polymersomes was directed by W/O/W double emulsions during evaporation of the organic solvent in which the copolymer was dissolved. The formation of vesicles from diblock copolymers in microfluidic devices not only enables continuous fabrication of polymersomes with controlled size and narrow polydispersity (PDI), but also offers the ability to tune the polymersome size over several orders of magnitude from less than 50 nm using HFF to more than 100 micron using double-emulsion templates. To allow for the aforementioned studies, preliminary work focusing on increasing the resistance of PDMS towards swelling due to organic solvents was performed. By using a glass-like coating based on sol-gel chemistry, the swelling of PDMS was decisively decreased. Analyses of coated devices by scanning electron microscopy (SEM) illustrated that the coating could be homogeneously distributed even in complex microfluidic devices as employed for the preparation of double-emulsion templates. To simplify the fabrication of microfluidic devices with patterned wettability as required for the formation of double emulsions, a novel method to spatially pattern the surface properties of microchannels using flow confinement was developed. For a better understanding of the formation of double emulsions, a fundamental investigation of multiple emulsion formation in microfluidic devices in general was performed. Results show that, depending on the number of dripping instabilities present in the device, multiple emulsions can either be formed in a sequence of emulsification steps or in a one-step process. It was furthermore demonstrated that one-step formation of multiple emulsions provides a novel way to create emulsions from liquids, which otherwise cannot be emulsified controllably, such as viscoelastic polymer solutions or liquids exhibiting a low surface tension. Finally, the development of a novel microfluidic spray dryer based on a conventional microfluidic device for forming double emulsions was presented and its application for fabricating drug nanoparticles from hydrophobic active pharmaceutical ingredients (APIs) was demonstrated.

Charakterisierung des humanen Proteins MCM8 und seiner Interaktion mit CDC45 (2011)

Linda Holtkamp

In der eukaryotischen und archaealen DNA-Replikation spielen MCM-Proteine eine bedeutende Rolle. Ein heterohexamerer Komplex der Proteine MCM2-7 stellt in eukaryotischen Zellen die replikative Helikase dar, welche den DNA-Doppelstrang entwindet und so für die Replikation durch die DNA-Polymerasen zugänglich macht. In den Archaea übernimmt diese Aufgabe ein homohexamerer MCM-Komplex. Ein weiteres Mitglied der eukaryotischen MCM2-7-Familie ist MCM8. Es gibt Hinweise, dass MCM8 als homohexamere Helikase in der eukaryotischen DNA-Replikation involviert ist, die tatsächliche Funktion des Proteins ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Durch Untersuchungen von Tumorgeweben wurde gezeigt, dass humanes MCM8 in den entsprechenden Zellen akkumuliert oder mutiert vorliegt. Dies lässt darauf schließen, dass MCM8 an der Entwicklung von Tumoren beteiligt sein könnte. Für das Verständnis der Krebsentstehung ist daher die Erforschung seiner Funktion von großer Wichtigkeit. Ziel dieser Arbeit war zunächst, ein geeignetes Expressionssystem zu etablieren, in welchem rekombinantes humanes MCM8 löslich exprimiert und aufgereinigt werden kann. Hierfür wurden Expressionsstudien in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae sowie Sf9- und High-Five-Insektenzellen durchgeführt. In S. cerevisiae konnte keine Expression von MCM8 detektiert werden, da das Protein hier möglicherweise toxisch wirkt. In E. coli konnte MCM8 nach einer Co-Expression mit dem Chaperon E. coli Triggerfakor bei einer Expressionstemperatur von 15°C teilweise löslich exprimiert werden. In Insektenzellen konnte MCM8 sowohl in plasmidbasierter transienter Expression als auch in einer Baculovirus-basierten Expression vollständig löslich exprimiert werden. Das lösliche rekombinante MCM8 wurde mittels Affinitäts-, Heparin- sowie Ionenaustausch- chromatographie aufgereinigt und auf enzymatische Aktivität untersucht. Es war bekannt, dass die anderen MCM-Proteine eine DNA-abhängige ATPase-Aktivität besitzen, und dass diese durch die Mutation eines konservierten Lysinrests im aktiven Zentrum des Proteins ausgeschaltet werden kann. Um eine eventuelle ATPase-Aktivität MCM8 zuordnen zu können, wurde die Aktivität des Wildtyp-Proteins sowie die Aktivität der mutmaßlichen ATPase-Motiv-defekten Mutante MCM8 K460E überprüft. Weder für das in E. coli noch für das in Insektenzellen exprimierten rekombinanten Protein konnte eine ATPase-Aktivität nachgewiesen werden. Auch durch Zugabe von DNA konnte diese Aktivität nicht stimuliert werden. Dies ließ darauf schließen, dass humanes MCM8 alleine in vitro keine enzymatische Aktivität besitzt. Vermutlich benötigt MCM8 wie der MCM2-7-Komplex in vivo Cofaktoren zur Ausübung seiner Funktion. CDC45 und der GINS-Proteinkomplex gelten als essentielle Cofaktoren der Helikase MCM2-7, welche zusammen als CMG-Komplex den DNA-Doppelstrang entwinden. Wenn MCM8 als Helikase in die DNA-Replikation der eukaryotischen Zelle involviert ist, ist eine Interaktion mit CDC45 wahrscheinlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Interaktion von MCM8 mit humanem CDC45 nach Co-Expression der rekombinanten Proteine in High Five-Insektenzellen untersucht. Hinweise auf eine Interaktion von MCM8 und CDC45 ergaben sich zunächst durch eine Co-Aufreinigung der rekombinanten Proteine Strep_MCM8 und His_CDC45 mittels Talon- und anschließender Strep-Tactin-Chromatographie, in welchen beide Proteine in beiden Aufreinigungs-schritten co-eluierten. Einen weiteren Hinweis lieferte die Co-elution der Konstrukte MCM8_H10 und CDC45 in einer Gelfiltration. Durch Immunopräzipitation von MCM8_H10 und CDC45 aus High-Five-Zellextrakten, wo beide Proteine mit dem jeweiligen Interaktionspartner co-präzipitierten, konnte gezeigt werden, dass MCM8 und CDC45 in vitro interagieren. Eine in vivo-Interaktion der beiden Proteine wurde in HeLa-Zellen untersucht. Hier ergab sich ein Hinweis auf die Interaktion durch Immunopräzipitationen von CDC45 mit einem MCM8-Antikörper aus Zellextrakten logarithmisch wachsender HeLa-Zellen. Die Untersuchung fraktionierter Zellextrakte synchronisierter HeLa-Zellen lieferte Informationen über den Zeitpunkt und den Ort der Interaktion von MCM8 und CDC45 im Zellzyklus. Es ist bekannt, dass die Proteine MCM2-7 vor allem zu Beginn der Synthese-Phase chromatingebunden vorliegen. Hier konnte gezeigt werden, dass MCM8 und CDC45 gegen Ende der Synthese-Phase und am Übergang der G2- zur Mitose-Phase verstärkt chromatingebunden vorliegen. Dies lässt darauf schließen, dass das humane MCM8 eher in die Elongation als in die Initiation der eukaryotischen DNA-Replikation involviert ist. Es ist ebenfalls denkbar, dass MCM8 eine bisher noch nicht untersuchte regulatorische Funktion besitzt. Die tatsächliche Rolle von MCM8 im eukaryotischen Zellzyklus bleibt weiterhin unklar, bedarf jedoch gerade im Hinblick auf seinen potenziellen Wert als Tumor-Marker weiterer Aufklärung.

Semiconductor Polymer Architectures using Click Chemistry and Controlled Radical Polymerization (2011)

Andreas Lang

Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Synthese und Charakterisierung von halbleitenden Seitenkettenpolymeren und –blockcopolymeren für die Anwendung in organischen Photovoltaik-Bauelementen. Besonderer Augenmerk liegt dabei auf der Entwicklung und der Anwendung von modernen Synthesetechniken für die einfache und reproduzierbare Synthese solcher Polymere, auch im größeren Maßstab. Methoden zur kontrollierten radikalischen Polymerisation wie NMRP und RAFT, die zu wohldefinierten Polymeren mit enger Molekulargewichtsverteilung führen können, und ihre Kombination mit polymeranalogen Reaktionen, wie der Kupfer-katalysierten Azid-Alkin Zykloaddition („Klick“ Chemie), wurden erfolgreich dazu verwendet komplexe Polymerarchitekturen zu synthetisieren. Mit dieser Methode sollte ein genereller Ansatz für die Synthese von halbleitenden Seitenkettenpolymeren entwickelt werden. Zwei Arten von Gerüstpolymeren, Poly(Propargylacrylat) und Poly(Propargyloxystyrol), wurden dabei verwendet. „Klick“ Chemie sollte es ermöglichen die thermischen, strukturellen, elektronischen und optischen Eigenschaften des Polymers durch eine modulare Substitution mit unterschiedlichen Halbleiterresten einzustellen. Das thermotrope Phasenverhalten der synthetisierten Polymere analysierten wir umfassend mittels Differentieller Wärmeflusskalorimetrie (DSC), temperaturabhängiger Polarisationsmikroskopie (POM), sowie temperaturabhängiger Röntgendiffraktometrie (XRD). Nanostrukturierte Aggregate wurden mittels Transmissions-Elektronen-Spektroskopie (TEM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM) untersucht. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit die umfassende Anwendbarkeit von „Klick“ Chemie und Techniken der kontrollierten radikalischen Polymerisation, wie NMRP und RAFT, für die Synthese von hochkomplexen Halbleiter-Polymerarchitekturen und bildet die Grundlage für eine vereinfachte und hochskalierbare Vorgehensweise für die Synthese von Halbleiterpolymeren und Blockcopolymeren.

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