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Warten auf die Transkription: Die humanen Elongationsfaktoren NELF und DSIF
(2009)
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Sabine Wenzel
- Die humanen Elongationsfaktoren negative elongation factor (NELF) und 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) sensitivity inducing factor (DSIF) sind Schlüsselfaktoren beim promotorproximalen Arretieren in der frühen Elongationsphase der Transkription. Dabei interagieren beide Faktoren direkt mit RNA-Polymerase II. NELF bindet über die RNA recognition motif (RRM)-Domäne der Untereinheit E zusätzlich an die naszierende RNA. Eine derartige Transkriptionsblockade tritt auch während der Transkription des Genoms des humanen Immunschwächevirus 1 (HIV-1) Provirus auf. NELF bindet hierbei an die Haarnadel-Struktur der naszierenden RNA (HIV-1 TAR RNA). Ein Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Analyse der RRM-Domäne von NELF E sowie die Untersuchung einer möglichen sequenzspezifischen Bindung von NELF E RRM an HIV-1 TAR RNA. Außerdem galt es, die Struktur der kleinen Untereinheit von DSIF, hSpt4, zu bestimmen und ihre Interaktion mit der NGN-Domäne der großen DSIF-Untereinheit hSpt5 näher zu charakterisieren. Die Struktur der RRM-Domäne von NELF E wurde mittels magnetischer Kernresonanz (NMR) bestimmt (PDB: 2BZ2) und besteht aus einem viersträngigen Faltblatt mit zwei alpha-Helices, die gegen eine Seite des Faltblattes packen. An der RNA-Bindung sind die zentralen beta-Stränge mit den beiden aromatischen Resten Tyr43 und Phe77 aus dem Konsensussequenzmotiv ribonucleoprotein domain 2 (RNP2) bzw. RNP1 involviert. Der in der freien Form unstrukturierte C-Terminus der RRM bildet in der gebundenen Form (PDB: 2JX2) eine 3-10-Helix aus, die höchstwahrscheinlich direkt an der RNA-Bindung beteiligt ist. RRM-Domänen gelten als klassische einzelstrangbindende Domänen. Die prognostizierte Bindestelle von NELF E ist jedoch die doppelsträngige HIV-1 TAR RNA Stammregion. Die durchgeführten 15N-NMR-Titrationsexperimente und Fluoreszenzgleichgewichtstitrationen mit die HIV-1 TAR RNA umfassenden RNA Oligonukleotiden zeigten, dass NELF E RRM präferentiell einzelsträngige RNA bindet. Die ermittelten KD-Werte lagen dabei alle im niederen mikromolekularen Bereich. NELF E RRM zeigt somit im Vergleich zu anderen RRM-Domänen eine schwächere Affinität für RNA. Eine sequenzspezifische Bindung an die HIV-1 TAR RNA konnte, auch in Versuchen mit der gesamten NELF E Untereinheit, nicht beobachtet werden. Vieles deutet somit darauf hin, dass RNA-Bindung durch NELF E sequenzunabhängig stattfindet. Der Zeitpunkt der RNA-Bindung während der Elongation der Transkription wird womöglich durch andere Faktoren bzw. Ereignisse gesteuert. NELF übt seine inhibitorische Wirkung nur im Zusammenspiel mit dem Elongationsfaktor DSIF aus, über den es nur wenig strukturelle Informationen gibt. Die Koexpression von hSpt4 mit der NusG N-terminalen Homologie Domäne von hSpt5 (hSpt5-NGN) als dessen Interaktionspartner ermöglichte die Bestimmung der Kristallstruktur von hSpt4/hSpt5-NGN bis zu einer Auflösung von 1.55 Å (PDB: 3H7H). hSpt5-NGN besteht aus einem zentralen, viersträngigen Faltblatt und aus einzelnen Helices, die von beiden Seiten gegen das Faltblatt packen. hSpt4 verfügt über ein zwei- und ein dreisträngiges Faltblatt, die senkrecht zueinander angeordnet sind und sich auf der Interaktionsfläche zugewandten Seite befinden. Zusätzliche helikale Elemente werden durch den ausgebildeten Zinkfinger fixiert. Die Komplexstruktur ist von einem zentralen sechssträngigen intermolekularen beta-Faltblatt geprägt. hSpt4/hSpt5-NGN zeigt sehr große Strukturähnlichkeit zur kürzlich publizierten homologen Komplexstruktur von Spt4/Spt5-NGN aus S. cerevisiae. Ein für die Bindung essentieller Glutamatrest (E338) von Spt5-NGN ist auch in hSpt5-NGN konserviert (E228). Der Komplex hSpt4/hSpt5-NGN(E228Q) konnte wegen der Unlöslichkeit von hSpt5-NGN(E228Q) nicht gereinigt werden. Dies deutet an, dass die Interaktion zwischen hSpt4 und hSpt5-NGN(E228Q) gestört ist. Somit ist E228 von hSpt5-NGN höchstwahrscheinlich ebenso essentiell für die Wechselwirkung mit hSpt4 wie im homologen Hefekomplex. hSpt5-NGN hat auch strukturelle Ähnlichkeiten zur N-terminalen Domäne (NTD) des bakteriellen Transkriptionsfaktors NusG. E. coli (Ec)NusG-NTD verfügt an der Position des Glutamatrestes über einen Glutaminrest (Q72). hSpt4-Bindung an EcNusG-NTD bzw. EcNusG-NTD(Q72E) wurde jedoch nicht beobachtet. Ein möglicher Grund dafür ist die unterschiedliche Ladungsverteilung an der hSpt4-Bindungsfläche. hSpt4 besitzt hingegen Ähnlichkeiten zum archaealen Transkriptionsfaktor RpoE‘‘. Überlagerung der Strukturen von hSpt4 und RpoE‘‘ aus P. furiosus (PDB: 1RYQ) zeigten, dass beide den Zinkfinger und die senkrecht zueinander angeordneten Faltblätter gemein haben. Strukturbestimmung sowie funktionelle Analyse von NELF E RRM und hSpt4/hSpt5-NGN repräsentieren somit einen weiteren Schritt auf dem Weg zur Entschlüsselung der komplexen zellulären Vorgänge während der eukaryontischen Transkription.
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Characterization of phase transitions by the analysis of crystal structures
(2009)
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Joachim Angelkort
- In this thesis results of the investigations of the mechanisms of solid-solid phase transitions are reported on basis of the exemplary characterization of the phase transition of the metalorganic compound Eu(SC36H49)2 and of the inorganic transition-metal compounds TiI3 and CrOCl. The phase transitions were surveyed temperature dependently by the performance of single-crystal X-ray diffraction experiments and measurements of the magnetic susceptibility. The X-ray diffraction experiments were carried out as data collections of integrated intensities of reflections and as measurements of profiles on selected reflections in so-called omega-2theta maps. The data sets of the integrated intensities were used to determine the crystal structures at different temperatures. By the comparison of the high- and the low-temperature crystal structures the mechanisms of the phase transitions of the compounds Eu(SC36H49)2 and TiI3 were determined. Furthermore the transition temperatures of all three compounds were determined by temperature-dependent measurements of intensities of superstructure reflections. From the omega-2theta maps the monoclinic lattice distortion of the low-temperature phase of CrOCl was determined.
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Das Gen-3-Protein filamentöser Phagen als Modellsystem zur Untersuchung von Proteinstabilität, Faltungsmechanismen und Prolylisomerisierung
(2009)
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Roman Jakob
- Proteine sind die funktionstragenden Moleküle in lebenden Zellen und ihre pharmazeutische und biotechnologische Anwendung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Um ihre Funktion zu erlangen, müssen Proteine falten und die gefaltete Struktur möglichst lange beibehalten. Die Faltungsmechanismen und die Grundlagen der konformationellen Stabilität von Proteinen zu verstehen, ist daher eines der zentralen Ziele der biophysikalischen und biochemischen Forschung. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das Gen-3-Protein des Phagen fd. Sein Faltungsmechanismus ist aufs Engste mit seiner biologischen Funktion verknüpft, und es ist ein Modellsystem für die Untersuchung von Proteinfaltung, -stabilität und Prolylisomerisierung. Die isolierte N2-Domäne des Gen-3-Proteins im Mittelpunkt der Arbeit. Dabei zeigte sich, dass in der nativen N2-Domäne ein cis/trans-Gleichgewicht an Pro161 existiert, das entscheidend für die Stabilität und Faltung des Proteins ist. Solche Heterogenitäten an Prolinresten werden als potentiell wichtige regulatorische Schalter in biologischen Systemen diskutiert, konnten aber bislang kaum untersucht werden. Während der Faltung von N2 wird der cis-Anteil an Pro161 von 7 % im denaturierten Protein auf 89 % im nativen Protein erhöht, was einem Energieaufwand von 10 kJ mol-1, der Hälfte der insgesamt verfügbaren Konformationsenergie des nativen Protein, entspricht. Um diese Kopplung auf molekularer Ebene zu verstehen, wurde die lokale Sequenzumgebung von Pro161 systematisch variiert. In der cis-Form zeigte die Schleife um Pro161 eine definierte native Konformation. Die energetische Kopplung zwischen der cis-Form an Pro161 und den Faltblattsträngen ist dabei schon im Übergangszustand der Faltung voll ausgebildet. In der trans-Form hingegen ist die Schleife entfaltet, und es besteht keine energetische Kopplung mit dem Beta-Faltblatt. Die Beiträge der einzelnen Bereiche der N2-Domäne zur Struktur und zur Energetik des Übergangszustands der Faltung wurde mit Hilfe einer Phi-Wert-Analyse analysiert. Es sind zwar fast alle Bereiche für die Stabilität des nativen Proteins wichtig, den Faltungsprozeß hingegen bestimmt nur ein eng begrenzter Faltungsnukleus. Die trans-cis-Isomerisierung an Pro161 in der N2-Domäne lässt sich sehr gut durch Prolylisomerasen katalysieren. Um die Substratspezifität von Prolylisomerasen der FKBP-Familie untersuchen zu können, wurde eine Bibliothek von N2-Varianten mit allen natürlichen Aminosäuren vor Pro161 hergestellt. Prolylisomerasen, die nur aus einer katalytischen Domäne bestehen, zeigen für kurze Peptide und für faltende Proteine die gleiche Substratspezifität, mit einer sehr starken Präferenz für hydrophobe Reste vor Prolin. Besitzen die Prolylisomerasen zusätzlich eine Chaperondomäne, wie SlyD oder Triggerfaktor, dann ist ihre Aktivität praktisch unabhängig von der Aminosäure vor Prolin. Der Grund dafür ist, dass die enzymkinetischen Parameter der katalysierten Faltung, die Affinität und die Umsatzzahl durch die Chaperondomäne bestimmt werden. Die N2-Domäne besitzt nur eine marginale Stabilität. Deshalb wurde mit diesem Protein untersucht, inwieweit Proteine durch rationales consensus design von Beta-Turns stabilisiert werden können. Für N2 konnte durch Sequenzoptimierung von drei Beta-Turns die Stabilität tatsächlich praktisch verdoppelt werden, was die generelle Anwendbarkeit dieser Methode verdeutlicht. Interessanterweise führt diese Turnoptimierung auch zu einer sehr starken Beschleunigung der Faltung von N2, offensichtlich weil diese Beta-Turns bereits sehr früh im Faltungsprozess von Proteinen wichtig sind, da sie Bildung von nativen Interaktionen in den benachbarten Bereichen ermöglichen. Im Gen-3-Protein des Phagen fd tritt während der in-vitro-Faltung ein langlebiges Intermediat mit einem trans-Prolin213 auf. Mittels NMR-Spektroskopie wurde herausgefunden, das in diesem Intermediat die N1- und die N2-Domäne bereits ihre native chemische Verschiebung zeigen, aber die Gelenkdomäne zwischen den Domänen nur teilweise strukturiert ist. In der anschließenden Domänenassemblierungsreaktion werden als Folge der trans-cis Isomerisierung an Pro213 besonders Wasserstoffbrückenbindungen stark stabilisiert, die eine Kette zwischen der Grenzfläche von N1 und der Gelenkregion bilden. Die Ergebnisse zur Kopplung zwischen cis/trans Isomeren an Pro213 entsprechen konzeptionell dem Mechanismus an Pro161 in der N2-Domäne. Am Beispiel des Gen-3-Proteins des Phagen IKe wurde untersucht, ob alle Gen-3-Proteine filamentöser Phagen eine ähnliche Struktur und Faltungsmechanismus besitzen. Dabei zeigte sich, dass die TolA-bindenden Domänen beider Proteine strukturell und funktionell stark konserviert sind. Die jeweiligen pilusbindenden Domänen sind dagegen architektonisch komplett verschieden, da sie spezifisch an den jeweiligen Wirt adaptiert wurden. Deshalb sind vermutlich die Faltungsmechanismen dieser Mehrdomänenproteine, und damit auch die Infektionsmechanismen grundlegend verschieden.
