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Novel Functional Membrane Precursors based on Triblock Terpolymer Thin Films
(2009)
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Alexandra Sperschneider
- In dieser Studie wurden neuartige, funktionelle Vorstufen für Dünnfilm-Membranen auf Basis von Polybutadien-block-poly(2-vinylpyridin)-block-poly(tert-butylmethacrylat) (BVT) Dreiblockterpolymeren identifiziert. Durch geschickte Kombination des gummiartigen Polybutadiens (PB), des pH-responsiven und mit Metallen beladbaren Poly(2-vinylpyridin) (P2VP) und des strahlungsempfindlichen Poly(tert-butylmethacrylats) (PtBMA), sind seitens der Polymersynthese die besten Voraussetzungen für synthetische Membranvorstufen geschaffen. Dünnfilme mit einer Dicke von kleiner 100 nm wurden sowohl mittels Lackschleudern als auch mittels Ziehvorrichtung zur Erstellung von Dickegradienten auf unterschiedlichen Substraten hergestellt. Im Anschluss wurden die selbstangeordneten Strukturen während des kontrollierten Lösungsmittelbedampfens in ein thermodynamisches Gleichgewicht überführt und mittels (Quasi in-situ) Rasterkraftmikroskopie und Elektronemikroskopie charakterisiert.
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Warten auf die Transkription: Die humanen Elongationsfaktoren NELF und DSIF
(2009)
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Sabine Wenzel
- Die humanen Elongationsfaktoren negative elongation factor (NELF) und 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) sensitivity inducing factor (DSIF) sind Schlüsselfaktoren beim promotorproximalen Arretieren in der frühen Elongationsphase der Transkription. Dabei interagieren beide Faktoren direkt mit RNA-Polymerase II. NELF bindet über die RNA recognition motif (RRM)-Domäne der Untereinheit E zusätzlich an die naszierende RNA. Eine derartige Transkriptionsblockade tritt auch während der Transkription des Genoms des humanen Immunschwächevirus 1 (HIV-1) Provirus auf. NELF bindet hierbei an die Haarnadel-Struktur der naszierenden RNA (HIV-1 TAR RNA). Ein Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Analyse der RRM-Domäne von NELF E sowie die Untersuchung einer möglichen sequenzspezifischen Bindung von NELF E RRM an HIV-1 TAR RNA. Außerdem galt es, die Struktur der kleinen Untereinheit von DSIF, hSpt4, zu bestimmen und ihre Interaktion mit der NGN-Domäne der großen DSIF-Untereinheit hSpt5 näher zu charakterisieren. Die Struktur der RRM-Domäne von NELF E wurde mittels magnetischer Kernresonanz (NMR) bestimmt (PDB: 2BZ2) und besteht aus einem viersträngigen Faltblatt mit zwei alpha-Helices, die gegen eine Seite des Faltblattes packen. An der RNA-Bindung sind die zentralen beta-Stränge mit den beiden aromatischen Resten Tyr43 und Phe77 aus dem Konsensussequenzmotiv ribonucleoprotein domain 2 (RNP2) bzw. RNP1 involviert. Der in der freien Form unstrukturierte C-Terminus der RRM bildet in der gebundenen Form (PDB: 2JX2) eine 3-10-Helix aus, die höchstwahrscheinlich direkt an der RNA-Bindung beteiligt ist. RRM-Domänen gelten als klassische einzelstrangbindende Domänen. Die prognostizierte Bindestelle von NELF E ist jedoch die doppelsträngige HIV-1 TAR RNA Stammregion. Die durchgeführten 15N-NMR-Titrationsexperimente und Fluoreszenzgleichgewichtstitrationen mit die HIV-1 TAR RNA umfassenden RNA Oligonukleotiden zeigten, dass NELF E RRM präferentiell einzelsträngige RNA bindet. Die ermittelten KD-Werte lagen dabei alle im niederen mikromolekularen Bereich. NELF E RRM zeigt somit im Vergleich zu anderen RRM-Domänen eine schwächere Affinität für RNA. Eine sequenzspezifische Bindung an die HIV-1 TAR RNA konnte, auch in Versuchen mit der gesamten NELF E Untereinheit, nicht beobachtet werden. Vieles deutet somit darauf hin, dass RNA-Bindung durch NELF E sequenzunabhängig stattfindet. Der Zeitpunkt der RNA-Bindung während der Elongation der Transkription wird womöglich durch andere Faktoren bzw. Ereignisse gesteuert. NELF übt seine inhibitorische Wirkung nur im Zusammenspiel mit dem Elongationsfaktor DSIF aus, über den es nur wenig strukturelle Informationen gibt. Die Koexpression von hSpt4 mit der NusG N-terminalen Homologie Domäne von hSpt5 (hSpt5-NGN) als dessen Interaktionspartner ermöglichte die Bestimmung der Kristallstruktur von hSpt4/hSpt5-NGN bis zu einer Auflösung von 1.55 Å (PDB: 3H7H). hSpt5-NGN besteht aus einem zentralen, viersträngigen Faltblatt und aus einzelnen Helices, die von beiden Seiten gegen das Faltblatt packen. hSpt4 verfügt über ein zwei- und ein dreisträngiges Faltblatt, die senkrecht zueinander angeordnet sind und sich auf der Interaktionsfläche zugewandten Seite befinden. Zusätzliche helikale Elemente werden durch den ausgebildeten Zinkfinger fixiert. Die Komplexstruktur ist von einem zentralen sechssträngigen intermolekularen beta-Faltblatt geprägt. hSpt4/hSpt5-NGN zeigt sehr große Strukturähnlichkeit zur kürzlich publizierten homologen Komplexstruktur von Spt4/Spt5-NGN aus S. cerevisiae. Ein für die Bindung essentieller Glutamatrest (E338) von Spt5-NGN ist auch in hSpt5-NGN konserviert (E228). Der Komplex hSpt4/hSpt5-NGN(E228Q) konnte wegen der Unlöslichkeit von hSpt5-NGN(E228Q) nicht gereinigt werden. Dies deutet an, dass die Interaktion zwischen hSpt4 und hSpt5-NGN(E228Q) gestört ist. Somit ist E228 von hSpt5-NGN höchstwahrscheinlich ebenso essentiell für die Wechselwirkung mit hSpt4 wie im homologen Hefekomplex. hSpt5-NGN hat auch strukturelle Ähnlichkeiten zur N-terminalen Domäne (NTD) des bakteriellen Transkriptionsfaktors NusG. E. coli (Ec)NusG-NTD verfügt an der Position des Glutamatrestes über einen Glutaminrest (Q72). hSpt4-Bindung an EcNusG-NTD bzw. EcNusG-NTD(Q72E) wurde jedoch nicht beobachtet. Ein möglicher Grund dafür ist die unterschiedliche Ladungsverteilung an der hSpt4-Bindungsfläche. hSpt4 besitzt hingegen Ähnlichkeiten zum archaealen Transkriptionsfaktor RpoE‘‘. Überlagerung der Strukturen von hSpt4 und RpoE‘‘ aus P. furiosus (PDB: 1RYQ) zeigten, dass beide den Zinkfinger und die senkrecht zueinander angeordneten Faltblätter gemein haben. Strukturbestimmung sowie funktionelle Analyse von NELF E RRM und hSpt4/hSpt5-NGN repräsentieren somit einen weiteren Schritt auf dem Weg zur Entschlüsselung der komplexen zellulären Vorgänge während der eukaryontischen Transkription.
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Kristallstruktur der Selen-abhängigen Nicotinat-Dehydrogenase aus Eubacterium barkeri
(2009)
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Nadine Wagener
- Eubacterium barkeri ist ein gram-positives, anaerobes Bakterium, das zur Ordnung der Clostridien gehört. Es ist der einzige bekannte Organismus, der Nicotinat fermentativ zu Propionat, Acetat, CO2 und NH4+ abbauen kann. Initiert wird dieser Abbauweg durch eine Selen-abhängige Nicotinat-Dehydrogenase, die zur Familie der Molybdän-abhängigen Xanthin-Oxidoreduktasen gehört. Xanthin-Oxidoreduktasen sind große, meist dimere Moleküle die ihr Substrat unter gleichzeitiger Oxidation hydroxylieren. Katalysiert wird diese Reaktion durch einen charakteristischen Molybdän-Kofaktor, der im Verlauf der Reaktion als Hydrid-Akzeptor, Proton-Donor und Hydroxyl-Donor fungiert. Die Elektronen werden vom Molybdän aus über eine kurze Elektronentransport-Kette, bestehend aus zwei [2Fe2S]-Zentren sowie häufig einem FAD-Molekül, auf einen externen Elektronenakzeptor übertragen. Durch Wachstum auf Nicotinat-haltigem Medium wurde die NDH in E. barkeri exprimiert. Es wurden verschiedene Reinigungsstrategien entwickelt die, in Bezug auf Reinheit und Aktivität, den Anforderungen der jeweiligen Kristallisation angepasst waren. Die kurze Halbwertzeit des instabilen Enzyms konnte durch eine verkürzte Reinigung von wenigen Stunden auf mehrere Tage verlängert werden. Die Kristallisation des sauerstoffempfindlichen Enzyms erfolgte unter anaeroben Bedingungen, durch die Methode der Gasphasendiffusion im hängenden Tropfen. Die Struktur der NDH konnte bei 2,2 Å gelöst werden. Die NDH ist eine typische Xanthin-Oxidoreduktase mit einer dimeren Grundstruktur, sowie jeweils einer Molybdän- , Flavin- und Eisen-Schwefel-Untereinheit je Monomer. Weiter war es möglich, das Enzym in aktiver Form, d.h. mit Selen-haltigem Molybdän-Kofaktor zu kristallisieren und seine Struktur bei 2,5 Å zu lösen. Der Nachweis des Selens erfolgte unter Verwendung der anomalen Streuung des Selens am ESRF. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass das Selen als endständiger Ligand des Molybdäns eine äquivalente Position einnimmt wie Schwefel im Kofaktor anderer Xanthin-Oxidoreduktasen. Die NDH ist die erste Nicotinat-Dehydrogenase, sowie die einzige Xanthin-Oxidoreduktase mit endständigem Selenoliganden, die bisher kristallisiert werden konnte. Letztlich handelt es sich auch um die erste Kristallstruktur eines Enzyms, dessen katalytisch involviertes Selen nicht in Form von Selenocystein Bestandteil des Proteins ist.
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Structure-function relationship of archaeal rhodopsin proteins analyzed by continuum electrostatics
(2009)
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Edda Kloppmann
- Rhodopsin proteins perform two cellular key functions: signaling of external stimuli and ion transport. Examples of both functional types are found in the family of archaeal rhodopsins, namely the proton pump bacteriorhodopsin, the chloride pump halorhodopsin and the photoreceptor sensory rhodopsin II. For these three membrane proteins, high-resolution X-ray structures are available, allowing a theoretical investigation in atomic detail. In this thesis, calculations are presented based on a continuum electrostatics approach using a finite-difference discretization of the Poisson-Boltzmann equation. The results can be divided into three parts. One of the interesting features of rhodopsin proteins is the extreme range over which the absorption maximum of their chromophore retinal is tuned. This characteristic and the precision of the tuning mechanism is a fundamental requirement for color vision. Using the archaeal rhodopsins as model systems, this work aims at advancing the understanding of the inter-protein absorption shift. The presented results demonstrate that the electrostatic interactions of the protein with the retinal are a major determinant of the inter-protein shift. The differences in electrostatic potential that the proteins cause at the retinal could be assigned to seven residues. A generalized model of a quantum mechanical particle in a box including the electrostatic potential as a parameter allows a qualitative description of the absorption maxima. Bacteriorhodopsin has become one of the most important model systems in the field of bioenergetics. This is due to its relative simplicity making it amenable to experimental and theoretical studies. Here, the probability of functionally relevant protonation states is calculated to characterize the available structures. The protonation behavior of the key residues of proton transfer and the correlation between the protonation of these residues is analyzed. The results show that with respect to the protonation the bR, K, L and M1 intermediate state are well represented by the available structures, while the M2, N and O intermediate state are less well represented. An algorithm is introduced that determines a gap-free list of the lowest energy states. Such a list allows to analyze the ensemble of states accessible to a system in a certain energy range and, thus, can provide useful insight into the functional mechanism. The newly developed algorithm, termed X-DEE, is based on the dead-end elimination theorem. The X-DEE algorithm is applicable to a wide range of problems, for instance in protein design attempts. Here, X-DEE is successfully applied to bacteriorhodopsin to obtain gap-free lists of the lowest energy protonation states.
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Designing novel host materials for blue phosphorescent organic light-emitting diodes
(2009)
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Michael Rothmann
- The overall efficiency of an organic light-emitting diode (OLED) is always limited to the efficiency of its individual components. The most important component is the emission layer, where excitons are formed and light is generated. This thesis deals with the improvement of one class of OLED component, namely host materials for blue phosphorescent emitters. Three generations of 1,3,5-triazine-based materials with varying donor-substituents are presented in this work. In the first generation carbazole units are bound to the triazine core. The second generation consists of triazines with diarylamino substituents. The third generation compounds are a combination of disubtituted triazines from the first two generations and a phenoxy-carbazole unit. While the first and second generation comprise substituents that are directly bound to the triazine core, in the third generation triazines the phenylcarbazole-donor is attached via a nonconjugated ether bond. Within each generation various properties are tailored to fulfill the complex profile of requirements for host materials. Known nucleophilic substitution reactions were further improved to enable the efficient synthesis of novel host materials in very high purity and high yields. The sequential replacement of the chlorines of cyanuric chloride is dependent on temperature, actual ring substitution and the nature of the nucleophile. Effective methods were developed to yield asymmetrically substituted triazines in a controlled manner. The thermal properties, including the thermal stability to enable the processing by vapor deposition and the glass forming properties to result in a morphological stability of prepared thin emission layers, were controlled by systematic investigation of different substitution patterns. Thus, glass transition temperatures up to 170 °C are presented. Studies of the long term stability of amorphous host films, carried out for several materials, revealed its importance for long term efficient devices. The electrochemical properties of the novel compounds were investigated by cyclic voltammetry to study the energetic position of the HOMO and the LUMO as well as the stability of the material upon oxidation and reduction. Using this method the injection properties of the materials were determined. The blocking of activated positions resulted in reversible redox behavior. Furthermore the ionization potential was decreased for the third generation triazines to yield an improved hole injection into these materials. Additionally computational calculations were carried out to understand and further improve the energy levels by substituent exchange. This led directly to the development of bipolar host materials with separated hole and electron transport units within one molecule. Furthermore single carrier devices were fabricated to demonstrate the benefits of the transport bipolar characteristics. For the efficient operation of a device the triplet energy of the host material has to be higher compared to the emitter. First generation triazines exhibit triplet energies up to 2.96 eV and therefore enable the use of light and middle blue phosphorescent emitters. Second generation triazines comprise exceptionally high triplet energies up to 3.24 eV. These are amongst the highest values reported in the literature and facilitate the use of deep blue phosphorescent emitters. For hosts of the third generation the triplet energy depends on the choice of the triazine moiety. They are therefore suited for light and deep blue emitter. Extensive photo physical characterizations of all materials have been carried out in solutions, neat films and doped films. Energy transfer experiments with several emitters additionally gained valuable information about the compatibility of host and guest molecules All generations of triazines are tested as host material in OLEDs. The optimization of the device configurations was carried out by combinatorial evaporation. The sequential adaption of layer thickness and composition helped to improve the device performance. The stepwise optimization of the host material properties resulted in an enduring progression concerning the luminance and efficiency. For the third generation triazines 11.5 % external quantum efficiency and a high brightness of 33000 cd/m2 were achieved.
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Naturstoff-basierte Cytostatika mit verbesserter Tumorselektivität und Potential zur Überwindung von Wirkstoffresistenzen
(2009)
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Bernhard Biersack
- Mit Pt(II)-Komplexen der 6’-Aminomethylnicotinsäure konnte ein neues Metallkomplexfragment entwickelt werden, über das potentielle Wirkstoffe über wenige Syntheseschritte verbunden werden konnten. Eine erste erfolgreiche Entwicklung war ein (-)-Menthylester-Konjugat mit Potential zur Überwindung der problematischen Cisplatin-Resistenz bei Hodenkrebszellen. Anschließende Modifikationen der Terpen- und der Ligand-Komponente führten zu einem (+)-Cedrenyl-Derivat mit verbesserter Wirkung bei Cisplatin-resistenten Melanom- und Hodenkrebszellen, zu Menthol-Konjugaten mit Diaminopropionat- und -butyrat-Liganden und höherer Aktivität bei Darmkrebszellen, sowie zu Propyl-Spacer-verknüpften Menthol- und Neomenthol-Konjugaten mit ebenfalls verbesserter Wirkung bei diversen resistenten Krebsformen. Zur Erhöhung der Selektivität von Pt(II)-Verbindungen auf hormonabhängige Krebsarten wie Brustkrebs wurde in dieser Arbeit ihre Bindung an das Serumprotein SHBG optimiert, welches Estrogene und Androgene im Blut transportiert und im Zielgewebe akkumuliert. Eine erste Serie von Steroid-Konjugaten mit Pt(II)-Komplexen wies deutliche Struktur-Aktivitäts-Beziehungen hinsichtlich der Affinität zu SHBG auf. Vor allem über die 3-Hydroxy-Gruppe veresterte Estradiol- und Estron-Konjugate sowie ein über den D-Ring verknüpftes Testosteron-Konjugat zeigten eine starke Bindung an SHBG. Ru(Aren)-Komplexe besitzen in vielerlei Hinsicht Vorteile gegenüber Platinverbindungen. So führte die einfache Synthese von entsprechenden ternären Konjugat-Komplexen unter milden Bedingungen ausgehend von einem Ru(Aren)-Dimer zu Konjugaten mit dem Phase-III-Wirkstoff Abirateron, dem stark auf Nierenkrebs wirkenden Digitoxigenin, oder zwei Rezeptortyrosinkinase-inhibierenden Tyrphostin-Derivaten. Ein weiteres Projekt war die Synthese von Metallkomplexen mit Melophlinen, einer Familie mariner N-Methyl-3-acyltetramsäuren. Melophlin C wurde mit geeigneten Metall-Fragmenten zu den entsprechenden Metallkomplexen umgesetzt, wobei La(III)- und Ru(II)-Komplexe eine starke Wirkung auf Nierenkrebs- (A-498) und Leukämiezellen (U-937) im niedrigen mikro- bis sub-mikromolaren Bereich zeigten. Der giftige Pilzinhaltsstoff Illudin-M wurde aus Flüssigkulturen von Omphalotus olearius isoliert und derivatisiert. Dimer-Verbindungen, in welchen Illudin M mit Bipyridyldicarbonsäure oder mit Endothall über die Yamaguchi-Methode verestert wurde, zeigten eine erhöhte Wirkung auf Bauchspeicheldrüsenkrebs und eine verringerte Toxizität bei nicht-malignen Hautfibroblastenzellen. Nachfolgende Arbeiten führten zur einem Phthalester, der die oben genannten Diester in der Wirkung übertraf. Der dritte Themenkomplex dieser Arbeit befasste sich mit Derivaten des Phase-III-Wirkstoffs Combretastatin A-4 und dem Ziel, die Effizienz sowie die pharmakologischen Eigenschaften zu verbessern. Zur Konjugatsynthese eigneten sich in erster Linie bekannte Chalkon-Analoga. Bemerkenswert ist vor allem ein neues Pt-Konjugat, welches bei resistenten Tumorarten die Wirkung des freien Chalkons übertraf. Eine wertvolle Alternative zu den Chalkonen stellte ein hochwirksames Oxazol-verbrücktes Analogon dar, welches über die van-Leusen-Reaktion erhalten werden konnte. Ein Ru(II)-Konjugat, welches aus dem Isonicotinsäureester des Oxazols und einem Ru-Dimer hergestellt wurde, erzielte bei einem Darmkrebs mit WT-p53 eine verbesserte Wirkung und scheint durch die Ru(II)-Komponente einen zusätzlichen Wirkmechanismus zu besitzen, der möglicherweise über eine Schädigung der DNA verläuft. Außerdem wurden weitere Oxazol-Derivate synthetisiert. Ein Methylsulfanyl-Derivat konnte die Combretastatin-Resistenz des HT-29-Darmkrebses überwinden. Ein Oxazol-verbrücktes Analogon von Combretastatin A-1, welches eine p53-abhängige Wirkung zu besitzen scheint, konnte zu einem p-Chinon oxidiert werden. Abschließend wurde eine der meta-Methoxygruppen des 3,4,5-Trimethoxyphenyl-Rings gegen Halogene (Cl, Br) oder eine Amino-Gruppe ersetzt, und unterschiedlichste Oxazol- und N-Methylimidazol-verbrückte Derivate mit dieser Modifizierung hergestellt. Durch Überführung in HCl-Salze konnten wasserlösliche Vertreter mit ansprechender Antitumor-Aktivität erhalten werden, die für eine in-vivo-Anwendung in Testmäusen besonders geeignet sind.
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Die Regulation der Transkriptionsantitermination in Escherichia Coli.
(2009)
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Björn Burmann
- Die Transkription wird in den Zellen durch die RNA-Polymerasen (RNAP) katalysiert. Die bakterielle RNAP ist aus den zwei alpha, beta´, beta, omega-Untereinheiten aufgebaut. Das katalytische Zentrum wird durch die beta’- und beta-Untereinheit gebildet und sorgt für die Bildung der Phosphodiesterbindung. Die alpha- und omega-Untereinheiten sind für den korrekten Aufbau der RNAP verantwortlich, wobei Teile der alpha-Untereinheiten zusätzlich regulatorische Funktionen haben. Der Ablauf der Transkription ist in Initiation, Elongation und Termination unterteilt. Alle drei Phasen werden innerhalb der Zellen streng reguliert. Während der Elongation bewirkt die sogenannte Antitermination das Überlesen von Terminationssequenzen. Dieser zuerst beim Phagen Lambda identifizierte Mechanismus, beruht auf dem Aufbau eines Multi-Protein-Komplexes, bestehend aus den Escherichia coli (E. coli) Nus-Proteinen (A, B, E, G), der RNAP, der nut RNA-Sequenz und dem Lambda N-Protein. Die ribosomalen (rrn) Operons in E. coli werden durch intrinsische Antitermination reguliert. Fluoreszenz-Anisotropie-Messungen konnten zeigen, dass die Bildung des NusB:NusE Heterodimers und seine Bindung an die boxA der nut und rrn RNA-Sequenzen ein wichtiger Schritt im Aufbau des Antiterminationskomplexes ist. Für die sogenannte NusB101-Mutation, Asp118Asn, die den negativen Effekt von Mutationen in anderen Komponenten des Komplexes aufheben kann, konnte eine höhere Affinität zur Erkennungs-RNA gezeigt werden. Weitere Mutationen an dieser Position zeigten, dass die Aminosäureposition 118 zentral für die Stabilität der RNA-Bindung ist. Ein weiterer Bestandteil des Antiterminationskomplex ist das zwei Domänenprotein NusG, über dessen Interaktion innerhalb des Komplexes wenig bekannt war. Interaktionen für die beiden Domänen, die das NusG-Paralog RfaH konstituieren, sind in der Literatur beschrieben, wie es auch bei der Kristallisation von NusG aus Aquifex aeolicus gezeigt werden konnte. Für E. coli NusG konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass diese Interaktion konzentrationsabhängig, damit intermolekular, und sehr kurzlebig ist. Zusätzlich konnten Proteinbindungsflächen auf beiden Domänen bestimmt werden. Als Erkenntnis von zentraler Wichtigkeit und sehr weitreichenden Konsequenzen wurde in dieser Arbeit eine spezifische und strukturell sehr gut definierte Wechsel-wirkung der carboxy-terminalen Domäne von NusG mit NusE, das unter der Bezeichnung S10 auch ein Bestandteil der 30S Untereinheit des Ribosoms ist, identifiziert. Seit wenigen Wochen ist in der Literatur die Interaktion der amino-terminalen Domäne von NusG mit der RNA-Polymerase beschrieben. Die hier beobachtete Wechselwirkung der carboxy-terminalen Domäne von NusG mit NusE könnte damit zur Rekrutierung des NusB:NusE Heterodimers und zur Ausbildung eines kompakten Antiterminationskomplexes beitragen. Da NusE auch Teil des Ribosoms ist, stellt die NusG:NusE Interaktion möglicherweise die erste direkte molekulare Verbindung zwischen Transkription und Translation in Bakterien dar. Diese Kopplung von bakterieller Transkription und Translation ist ein sehr lange bekanntes, aber molekular nicht erklärtes Phänomen von außerordentlicher Bedeutung für die Überlebensfähigkeit von Bakterien. In ähnlicher Weise, wie das Lambda N-Protein, aber mit entgegengesetzter Wirkung – Termination statt Antitermination – bindet das Nun-Protein aus dem Phagen HongKong 022 an die boxB, eine Haarnadelschleife der nut Sequenz. Durch in vivo Studien wurde die Nun Tyr39Ala Mutante, die wichtige Hinweise für das Verständnis der Peptid-RNA-Interaktion lieferte, identifiziert. Durch diese Mutation ist eine ursprünglich als wichtig angesehene Wechselwirkung mit dem Adenosin 9 der boxB nicht mehr möglich. Molekulardynamikuntersuchungen zeigen deutliche Unter-schiede zur Lambda N:boxB Wechselwirkung auf, da die analoge Trp18:A9 Interaktion essentiell für prozessive Antitermination ist. Auf diese Weise lieferte diese Untersuchung wichtige Hinweise auf den molekularen Schaltmechanismus.
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Click Chemistry as Efficient Ligation Strategy for Complex Macromolecular Architecture and Surface Engineering
(2009)
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Anja Goldmann
- Click-Chemie wurde als Ligations-Strategie für die Synthese von cyclischen Polymeren und zur Oberflächenmodifizierung von großen Mikrokugeln und magnetischen Eisenoxidpartikeln verwendet. Das breite Spektrum dieses universellen und leistungsstarken Instruments im Bereich der komplexen makromolekularen Architektur und Oberflächenmodifizierung ist hier dargelegt. Cyclisches Polystyrol wurde mittels der Kombination der „Reversiblen Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungs-Polymerisation" (RAFT) und der kupferkatalysierten Huisgen [2+3] Cycloadditons Click-Reaktion synthetisiert. Ein Azido-funktionalisiertes Dithiobenzoat Click-RAFT-Agens wurde als Kettenüberträger in der RAFT Polymerisation von Styrol verwendet, die in niedermolekularen azido-terminierten Polymeren resultierte. Der Austausch der Dithio-Gruppe der Polymerkette wurde mit einem Alkin-modifizierten Initiator durchgeführt und führte zu einem heterotelechelischen linearen Polymerprecursor für die Click-Cyclisierung. Die Eigenschaften des makrocyclischen Polymers im Vergleich zum linearen Gegenstück wurden untersucht. Die Kombination aus mehreren Analytikmethoden konnte die cyclische Struktur beweisen. Aus den Viskositätsmessungen im guten Lösungsmittel THF wurde ein Kontraktionsfaktor g´ = [eta]cyc/[eta]lin = 0.70-0.74 bestimmt. Dieser Wert stimmt mit dem theoretisch bestimmten Wert g´=0.67 für theta-Bedingungen überein. Die Oberflächenmodifizierung von großen Poly(divinylbenzol) Mikrokugeln (pDVB, 1,3 mikrom) wurde mit zwei verschiedenen Strategien durchgeführt, zum einen der Huisgen [2+3] Cycloadditionsreaktion und zum anderen mit der Thiol-en Click-Chemie. Die pDVB Mikrokugeln besitzen eine dünne Oberflächenschicht die aus teilweise vernetztem und quellfähigem Poly(divinylbenzol) besteht und darüber hinaus über Vinylgruppen auf ihren Oberflächen verfügen die für eine Modifizierung zugänglich sind, beispielsweise einer direkter Oberflächenmodifizierung durch Pfropfungstechniken („grafting-to“). Die RAFT-Technik wurde benutzt um SH-funktionalisierte Poly(N-Isopropylacrylamid)-Polymere (pNIPAAm-SH) zu synthetisieren und oberflächenmodifizierte Mikrokugeln über Thiol-en-Reaktion zu generieren. Oberflächensensitive Charakterisierungsmethoden wurden zur Identifizierung der charakteristischen Polymerhülle auf der Außenschale verwendet. Die Visualisierung der Partikel wurde mit der Rasterelektronenmikroskopie (REM) durchgeführt. Suspensionsstudien der Mikrokugeln zeigen einen ansprechenden Gewinn der Hydrophilie nachdem sie mit pNIPAAm45 gepfropft wurden und somit nach der Oberflächenmodifizierung in Wasser suspendiert werden können. Diese Beobachtung wurde durch eine Trübungsstudie unterstützt. In einer alternativen Vorgehensweise wurden multifunktionelle Azido-funktionalisierte Mikrokugeln über die Thiol-En-Reaktion von 1-Azido-undecan-11-thiol mit den verbleibenden Doppelbindungen auf der Oberfläche und anschließender 1,3 Huisgen dipolarer Cycloadditionsreaktion hergestellt. Diese oberflächenmodifizierten Partikel wurden mit Poly(hydroxyethylmethacrylat) (pHEMA) gepfropft. Das Aufpfropfen von hydrophilen Polymeren auf hydrophobe Partikel kann die Suspendierungseigenschaften der Partikel im wässrigen Medium deutlich erhöhen. Schließlich wurden Magnetit-Nanopartikel (Fe3O4) mit der Huisgen [2+3] Cycloadditionsreaktion oberflächenmodifiziert. Dabei wurde ein vielseitiger biomimetischer Anker, Dopamin, verwendet um die Partikel zu stabilisieren und gleichzeitig zu funktionalisieren. Die Synthese eines Alkin-Dopamin-Derivats führt zu multifunktionellen stabilen Fe3O4-Nanopartikeln. Die Oberflächenmodifizierung wurde mit einem Azid-funktionalisierten Polyethylenglykol (PEG) und desweiteren mit einem Azid-modifizierten Rhodamin-Derivat durchgeführt. Diese Eisenoxid-Partikel wurden mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Mit diesem Ansatz können hydrophobe Fe3O4-Nanopartikel in wasserlösliche Partikel umgewandelt und in Wasser redispergiert werden. Außerdem führt die hydrophile PEG-Schicht zu einer biokompatiblen Hülle. Im Allgemeinen zeigen all diese neuen Anwendungen die Vielseitigkeit der Click-Chemie und erweitern die Bandbreite alternativer und einfacher Ansätze für Oberflächenmodifizierungsstrategien und den Zugang zu komplexer makromolekularer Architektur.
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Elektrochemische Detektion von RNA mittels Nukleinsäurehybridisierung
(2009)
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Christopher Pöhlmann
- Die Nukleinsäureanalytik, insbesondere die RNA-Analytik, ist ein wichtiges Werkzeug für die Diagnostik von pathogenen Mikroorganismen in der Medizin und Lebensmittelüberwachung. Weiterhin besitzt der Nachweis von RNA-Molekülen bei der Transkriptomanalytik in der Grundlagenforschung eine zentrale Bedeutung. Ziel der Arbeit war die Entwicklung neuartiger Detektionsverfahren für unterschiedliche RNA-Spezies. Die schnelle und einfache Durchführbarkeit, aber auch die Parameter Selektivität und Sensitivität der entwickelten Techniken waren dabei von besonderer Bedeutung. Zunächst wurde die Detektionsmethode anhand der Identifizierung von Mikroorganismen mittels 16S rRNA-Sandwich-Hybridisierung etabliert und optimiert. Mit Hilfe von 16S rRNA-Sequenzdatenbanken wurden geeignete Sondensequenzen zur spezifischen Erkennung von verschiedenen Bakterien ermittelt. Die prokaryontische 16S rRNA wurde unter Verwendung des thermostabilen Reporterenzyms Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius durch eine Ein-Schritt Sandwich-Hybridisierung nachgewiesen. Ein Spezies-spezifisches Oligodesoxynukleotid wird auf der Goldelektrode eines elektrochemisch-auslesbaren Biochips immobilisiert und bindet die bakterielle 16S rRNA. Zeitgleich bindet ein kovalentes Konjugat aus Esterase 2 und Detektions-Oligodesoxynukleotid an einem konservierten Bereich der 16S rRNA. Nach Optimierung dieses Nachweissystems wurde eine Nachweisgrenze von 500 Kolonie bildenden Einheiten Escherichia coli ermittelt. Neben der guten Sensitivität konnte eine gute Spezifität bis hin zur Stammdiskriminierung gezeigt werden. Gleichzeitig konnten mehrere Bakterien in einem Ansatz identifiziert werden. Die Validierung dieses neuartigen bakteriellen Nachweissystems erfolgte mit realen Fleischproben. Das Hygienerecht der EU verlangt die Kontrolle mikrobiologischer Kriterien während der gesamten Prozesskette der Lebensmittelherstellung. Klassische mikrobiologische Verfahren sind hierfür jedoch nur bedingt geeignet. Biosensoren in integrierten Analysesystemen könnten in Zukunft hierfür Verwendung finden und die Analytik beschleunigen und vereinfachen. Die Optimierung der Probenvorbereitung und der Biochipmessung führte zu einem Gesamtanalyseprozess, bestehend aus Kurzanreicherung, RNA-Isolierung und Biochipmessung, welcher den spezifischen E. coli Nachweis von einer Kolonie bildenden Einheit pro mL Probe innerhalb von sieben Stunden ermöglicht. Daher ist diese Methode prinzipiell sehr gut für die Anwendung in der Lebensmittelproduktion geeignet. Eine Signalamplifikation der elektrochemischen Nukleinsäuredetektion wurde durch Herstellung eines neuartigen Reporterenzymkonjugats erreicht. Dazu wurden mehrere Esterase 2-Moleküle auf der Oberfläche eines Polyamidoamin-Dendrimers der Generation 3 verankert, während ein Detektions-Oligodesoxynukleotid mit dem Kern des Dendrimers kovalent verknüpft wurde. Die Selektivität der Bakterienidentifizierung blieb bei Verwendung dieses Reporterenzymkonjugats unverändert gut. Jedoch wurde bei Verwendung des mehrfach markierten Dendrimers eine Nachweisgrenze von 50 Kolonie bildenden Einheiten Escherichia coli erreicht, was eine zehnfache Verbesserung der Nachweisgrenze im Vergleich zum vorher beschriebenen Esterase 2-Oligodesoxynukleotid-Konjugat darstellt. Derzeit stellt die schnelle und sensitive Expressionsanalyse von microRNAs eine große Herausforderung dar. Kürzlich wurde zudem gezeigt, dass diese als Biomarker für die Tumordiagnostik dienen können. Deshalb wurde auf Basis des etablierten Sandwich-Hybridisierungssystems ein so genannter Lückenhybridisierungsnachweis entwickelt. Eine Hybridisierung von immobilisiertem Fänger-Oligodesoxynukleotid, Esterase 2-Detektionsoligodesoxynukleotid und komplementärer RNA-Probe lässt eine Lücke zwischen Fänger- und Detektionssonde. Diese Lücke destabilisiert den Komplex, was bei höheren Temperaturen zu einem Zerfall führt. Ist dagegen die gewünschte microRNA anwesend, füllt diese die Lücke zwischen Fänger- und Detektionssonde aus, stabilisiert den Hybridisierungskomplex und immobilisiert das Reporterenzym in der Nähe der Elektrode. Dieses kann folglich elektrochemisch detektiert werden. Mittels Lückenhybridisierung konnten verschiedene microRNAs diskriminiert werden. Selbst einzelne Fehlbasenpaarungen führten zu einem signifikanten Signalabfall. Die Nachweisgrenze für microRNA beträgt 2 pM bzw. 2 attomol ohne jegliche vorherige Amplifikation der Nukleinsäuren. Nach Isolation der Gesamt-RNA aus einer humanen Mammakarzinomzelllinie konnte mit dieser Methode ein Expressionsprofil von vier verschiedenen microRNAs innerhalb von 60 Minuten erstellt werden. Die Methode der Lückenhybridisierung wurde auch erfolgreich auf die schnelle Expressionsanalyse von Boten-RNAs aus prokaryontischen und eukaryontischen Zellen angewandt.
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Crystalline Morphologies of Poly(butadiene)-b-Poly(ethylene oxide) Block Copolymers in n-Heptane
(2009)
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Adriana Mirela Mihut
- This thesis reports the development of micellar crystalline morphologies in a selective solvent. The phase diagram of solution morphologies as a function of the molecular composition of the semicrystalline poly(butadiene)-b-poly(ethylene oxide)(PB-b-PEO) block copolymers was investigated. The crystalline morphologies discussed here have been generated from selective solvent condition (70°C in n-heptane) via two thermal pathways: (A) by direct immersion into liquid nitrogen, where n-heptane becomes a poor solvent for both blocks at very low temperatures, and (B): by quenching to the crystallization temperature of the PEO, i.e., determined by the length of PEO block. In pathway B, n-heptane is a poor solvent only for the PEO block. At 70°C, the block copolymers self-assembled into micellar structures consisting of a PEO molten core and a soluble PB corona. As crystallization takes place in the PEO core, a fast quenching into liquid nitrogen results in the formation of crystalline micelles retaining the shape present in the molten state at 70°C (pathway A). In the case of pathway B, the competition between the PEO core crystallization and the self-assembly of the micellar units, is the driving force that dictates the morphological development, therefore crystallization breaks out the melt morphology. These studies, demonstrated that the PB-b-PEO block copolymers are a promising system models for developing a general route towards tunable crystalline morphologies. In a symmetric PB-b-PEO block copolymer, crystalline morphologies like spheres and meanders formed upon quenching into liquid nitrogen and at 30°C, respectively. The meander morphology consisting of branched lamellae with a crystalline PEO ribbon-like core and ellipsoidal endings was observed for the first time in solution. Investigations of the crystal development revealed that this structure formed via crystallization-induced aggregation of spherical micelles upon cooling. A systematic study of the effect of crystallization kinetics on the formed morphology upon crystallization-induced aggregation of spherical micelles of a symmetric PB-b-PEO block copolymer was discussed. We demonstrated that the resulting morphology is controlled by two competitive effects, namely, by the nucleation and growth of the PEO micellar core: at lower crystallization temperatures (Tc ≤ 30°C), a high nucleation rate leads to a meander-like morphology formation, whereas at higher crystallization temperatures (Tc > 30°C), a low nucleation rate favors the formation of twisted lamellae. For a highly asymmetric PB-b-PEO block copolymer, crystallization at -30°C induced the formation of crystalline micelles retaining the spherical shape present in the molten state at 70°C. However, a quenching into liquid nitrogen facilitated a transition to rod-like micelles caused by changes of solvent quality for the PB coronar chains. This triggers the onset of an interfacial instability, therefore the spherical micelles preferred to reorganize into a morphology with a smaller interfacial curvature. The low crystallinity of the PEO core imposed a stronger tendency of the rods to aggregate and to thicken into more stable morphologies as needle-like structures, with a preferred growth direction along the long axis. Finally, the micellar morphology diagram of the PB-b-PEO block copolymers has been studied as a function of the crystallization temperature and molecular composition of the blocks via two thermal pathways. Pathway A allowed morphological transitions from spheres to rods, worms or twisted cylinders with the increase of the crystalline content of the PEO core. In Pathway B, the sequence of spheres, cylinders, lamellae, platelets and dendrites structures is observed with the increases of the PEO block length. The aggregation number of the spherical micelles is affected by the weight fraction and crystallinity of the PEO block. Moreover, an increased chain folding was observed at a high PEO composition which reduced the lamellar thickness of the crystals. The competition between the PEO core crystallization and the aggregation of the micellar units leads to coexistence regions of lamellae with platelets and cylinders with platelets. The novelty of this thesis relies on the development of novel crystalline morphologies in a selective solvent, as well as, in the detailed analysis of the major parameters that govern morphological formation in a controlled manner.
