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Structural insights into RNA binding by NusA and interaction studies of Nun with E. coli Nus factors.
(2008)
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Sujatha Pagadala Santhanam
- In phage lambda, antitermination is initiated by the lambda-encoded N protein which recruits a number of host proteins called Nus factors. Several of these host proteins which are essential for effective transcription termination and antitermination have been identified, these includes NusA, NusB, NusE and NusG. The subject of this work is mainly focused on characterization of interactions between various Nus host factors in the termination and antitermination system by NMR spectroscopy. Like N protein, Nun also requires additional host factors for efficient termination. It has been reported already that NusA interacts with C-terminal region of Nun and also that Nun binding to NusA requires NusA ar1 region. On the basis of these results, 1H,15N-HSQC spectra were recorded to monitor the interaction between HK022-Nun and NusA ar1. NMR titration experiments between Nun and NusA clearly showed a lack of chemical shift perturbations. Therefore, it can be concluded that there is no intermolecular interaction between Nun and NusA ar1. Up to date, no information about the interaction between Nun and NusG as well as Nun and NusB are known. Titration experiments between Nun and both Nus factors, have also revealed no direct interaction. Altogether, it can be deduced that there might be no direct interaction between Nun and NusA ar1, and NusG, and NusB. The NusA transcription elongation protein, which binds nut site RNA, contains sequences corresponding to the S1 and KH classes of identified RNA binding domains. To gain comprehensive insights into binding surface on SKK domain upon nut RNA binding, backbone resonances of SKK domain was assigned using sequential C-alpha, C-beta and CO chemical shift information derived from an array of TROSY based triple-resonance experiments. With virtually complete backbone assignment (80.5 %) of the SKK domain it was possible to characterize the interaction between SKK domain and lambda nutL RNA by NMR titration experiments. Significant chemical shift changes observed on SKK domain upon addition of unlabeled lambda nutL RNA, had reflected a direct interaction. Mapping of chemical shift perturbations on SKK domain revealed that the RNA binding interface is mainly located in the KH domains. The results implied a sequence-specific RNA binding. In the free state, NusA cannot bind to RNA. Once alpha-CTD of RNA polymerase is bound to NusA the RNA binding inhibition is released. Direct interactions between alpha-CTD and NusA ar2 have been reported and therefore NusA ar2 could be a prime candidate for inhibiting the RNA binding of NusA. To further evaluate the autoinhibition effect of NusA ar2 on SKK domain, titrations between NusA ar2 and SKK domain have been performed. Upon NusA ar2 binding, notable chemical shift changes were observed in the KH1 region of SKK domain. The residues which were affected on binding to NusA ar2 were also affected during the SKK and lambda nutL titration experiments. The results are in good agreement with the proposed idea that NusA ar2 possibly occludes the RNA binding domains of NusA. To investigate the effect of alpha-CTD on RNA binding by NusA, titration of the complex containing SKK domain and NusA ar2 by gradually adding an increased molar ratio of alpha-CTD have been carried out. On addition of alpha-CTD, it was clearly observed that alpha-CTD displaced NusA ar2 from the complex suggesting that the inhibition of RNA binding by NusA ar2 could be released by alpha-CTD.
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Die Regulation der prokaryontischen Transkription auf molekularer Ebene
(2008)
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Stefan Josef Prasch
- In Escherichia coli wird die RNA-Synthese durch eine aus fünf Untereinheiten bestehende RNA Polymerase (RNAP) katalysiert. Für die Bildung der Phosphodiesterbindung in der RNA sind die beta- und beta’-Untereinheiten verantwortlich. Die aminoterminalen Domänen der beiden alpha-Untereinheiten sind für den korrekten Aufbau zuständig, während die durch einen flexiblen Linker verbundenen carboxyterminalen Domänen (alphaCTD) regulatorische Aufgaben erfüllen. Die zuletzt entdeckte omega-Untereinheit fördert ebenso den Aufbau, ist aber für das Überleben von Escherichia coli nicht notwendig. Der Ablauf der Transkription wird begrifflich in die Initiation, Elongation und Termination eingeteilt. Bei der Initiation bindet ein so genannter sigma-Faktor an die RNAP. Das so entstandene Holoenzym erkennt den Promotor und startet die RNA-Synthese. Der sigma-Faktor verlässt die RNAP, es bildet sich der Transkriptionselongationskomplex, der zu einer stark gesteigerten RNA-Syntheserate führt. Im letzten Schritt erfolgt der Kettenabbruch, woraufhin freigewordene RNAP erneut einen Transkriptionszyklus starten kann. Eine zentrale Rolle bei der Regulation der Elongation und Termination spielt das essentielle NusA Protein (N utilization substance A), das im Verbund mit NusB, NusE und NusG, vor allem die Geschwindigkeit der RNA-Synthese steuert. Der Aufbau von NusA aus sechs Domänen spiegelt die vielfältigen Aufgaben des Proteins. Die aminoterminale Domäne vermittelt die Interaktion mit der RNAP. Die RNA-Bindungsregion wird durch die S1-, KH1- und KH2-Domänen aufgebaut. Die beiden carboxyterminalen acidic repeats AR1 und AR2 erfüllen jeweils unterschiedliche Aufgaben, die bisher nur zum Teil aufgeklärt sind und im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Eine weitere Rolle spielt NusA bei der Antitermination. Dieser zuerst im Phagen lambda entdeckte Mechanismus bewirkt, dass die Transkription nicht an einem Terminationssignal abbricht. Das dafür notwendige Antiterminationssignal besteht aus zwei bestimmten RNA-Sequenzabschnitten, boxA und boxB, die durch eine Trennsequenz miteinander verbunden sind. Während die boxA sowohl im Phagen lambda als auch in den für die ribosomale RNA codierenden Operons stark konserviert ist, weist die boxB in den beiden genannten Fällen nur geringe Gemeinsamkeiten auf. Das NusA Protein bindet an das Antiterminationssignal und an die RNAP. Die so veränderte RNAP ist nun in der Lage, stromabwärts gelegene Terminationssignale zu überlesen. In dieser Arbeit wurde zuerst die Rolle der AR1 Domäne untersucht. Eine bereits bekannte Kristallstruktur zeigt AR1 in Komplex mit lambda N. Jedoch fehlt in dieser Struktur die zweite Hälfte des lambda N Bindungsmotives (Aminosäurereste 42 bis 47), ebenso wie AR2, was zur Vermutung führte, dass diese Domäne lambda N(42-47) binden könne. Zur Klärung dieser Frage wurden die beiden Domänen AR1 und AR2 jeweils einzeln kloniert und im Hinblick auf ihre Bindung an das lambda N Protein getestet. In dieser Arbeit wurde eine ausschließliche Bindung von AR1 an lambda N gefunden, inklusive der in der Kristallstruktur fehlenden Aminosäurereste. Zusätzlich induziert AR1 bei der Bindung eine helikale Konformation im Bereich des Arginin-reichen Motives von lambda N (Aminosäurereste 1 bis 22), wodurch ein theoretisches Modell der lambda N Funktionsweise bestätigt wurde. Zudem wurde die Interaktion von NusA-AR2 charakterisiert. Biochemische Daten ließen auf eine Wechselwirkung von NusA mit alphaCTD schließen. Basierend darauf wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass in diesem Fall ausschließlich AR2 für die Wechselwirkung mit alphaCTD verantwortlich ist. Mit Hilfe von NMR-Experimenten wurde im Anschluss daran die Komplexstruktur berechnet. Die resultierende Bindungsfläche seitens alphaCTD lieferte dabei Rückschlüsse, wie NusA möglicherweise die RNAP von der Initiations- in die Elongationsphase überführt. Ebenso erlaubten die neu gewonnenen Ergebnisse einen Vergleich der Bindungseigenschaften von AR1 und AR2. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Wechselwirkung von NusA mit dem Antiterminationssignal studiert. Dazu wurde eine NusA Deletionsmutante kloniert und gereinigt, die ausschließlich aus den bisher vermuteten RNA-Bindungsdomänen S1, KH1 und KH2 bestand. Anhand der gemessenen Fluoreszenzanisotropie-Daten wurde die Bindung im Bereich der Trennsequenz lokalisiert. Die schwächere Affinität des Phagen lambda Signals nutL und nutR im Vergleich zur ribosomalen RNA erklärt die Notwendigkeit des zusätzlichen Faktors lambda N im Phagen System.
