16 search hits
-
Molekularbiologische Gewinnung von RNase 40-124 Fragmenten zur Synthese von einheitlichen Glycoproteinen durch native chemische Ligation
(2007)
-
Christian Piontek
- Die Bereitstellung von einheitlichen Glycoproteinen ist wegen der Mikroheterogenität und der Probleme bei der Isolierung aus natürlichen Quellen eine ungelöste Aufgabe. Nur mit homogenem Material sind detaillierte Untersuchungen der Struktur-Wirkungsbeziehung möglich, was zur Optimierung von therapeutischen Glycoproteinen verwendet werden kann. Deshalb sollten Methoden zur Totalsynthese von uniformen Glycoproteinen etabliert werden. Dazu sollte die chemoselektive Reaktion von Thioestern und molekularbiologisch gewonnenen Fragmenten mit N-terminalem Cys über die native chemische Ligation (NCL) ausgenutzt werden. Diese Methode sollte mit dem Modellprotein Ribonuclease 1-124 entwickelt werden. Zur Synthese der RNase durch NCL wurde das Cys 40 als Ligationsstelle gewählt. Das Fragment 40-124 B mit N-terminalem Cys sollte mit dem Thioester Met-RNase 1-39 A bzw. glycosylierten Varianten über sequentielle Ligationsschritte zur RNase ligiert werden. Zur Gewinnung des N-terminalen Cys-fragmentes 40-124 B der RNase wurde das pTWIN-Expressionssystem verwendet, das die autokatalytische Spaltung von Inteinen ausnutzt. Durch Expression des Plasmids pTWINcp1 in E. coli konnte das Fusionsprotein als unlösliche IBs erhalten werden. Diese wurden gereinigt, solubilisiert und unter optimierten Bedingungen rückgefaltet. Trotz einer fast vollständigen Inteinspaltung konnte das oxidationsempfindliche und möglicherweise unlösliche Zielpeptid RNase 40-124 B nicht isoliert werden. Deshalb wurden die sieben Cys von B vor der Rückfaltung und Inteinspaltung durch gemischte Disulfide geschützt. Die Reaktion mit GSSG oder DTDP ergab eine Mischung von Peptiden 1, 3, 5 und 7 modifizierten Cys. Die vollständige Reaktion aller Cys gelang mit 2-Carboxyethyl-methanthiosulfonat, jedoch bei geringerer Spaltungseffizienz des Inteins. Nach Reinigung mittels RP-HPLC konnte das 7-fach geschützte und nicht mehr oxidationsempfindliche Fragment 3 in einer Ausbeute von 3.5 mg pro Liter Medium erhalten werden. Die Ligationsfähigkeit der modifizierten Fragmente 1 und 2 wurde mit den Thioester Met-RNase 1-39 4 und dem Glyco-Thioester RNase 30-39 8 untersucht und die Reaktion zu 5 und 9 durch LC-MS bestätigt. Mit Hilfe des vollständig modifizierten Fragmentes RNase 40-124 3 konnte unter optimierten Ligationsbedingungen die vollständige Met-RNase 1-124 5 erhalten werden und nach einem Rückfaltungsschritt die enzymatische Aktivität durch Hydrolyse von 2’,3’-CMP nachgewiesen werden. Die Synthese von glycosylierter RNase 1-124 sollte durch eine sequentielle Ligationsstrategie versucht werden. Dazu wurde das Fragment 1-39 in den Thioester 1-25 F und den glycosylierten Thioester 26-39 D geteilt, dessen N-terminales Cys durch verschiedene Schutzgruppen maskiert wurde. Die Ligation zwischen dem vollständig SCE-geschützten Fragment RNase 40-124 3 und den Thioestern Thz-26-39 15 bzw. Mapoc-26-39 20 konnte durchgeführt werden. Die Ligation zu 16 bzw. 21 und die Abspaltung der Schutzgruppen unter Freisetzung des N-terminalen Cys konnte mittels LC-MS nachgewiesen werden. Zwar konnte nach der Öffnung des Thiazolidinringes mit Methoxyamin eine Ligation mit dem Thioester RNase 1-25 18 zur vollständigen RNase 1-124 19 nachgewiesen werden, allerdings reagierte der größte Teil des Thioesters mit Methoxyamin zum Methoxyamid. Deshalb wurde anstelle der sequentiellen Eintopf-Ligationsstrategie ein Syntheseweg mit Isolierung des Ligationsproduktes 26-124 nach der Methoxyaminentschützung angewandt. Diese Methode konnte mit den Ligationsprodukten RNase Thz-26-124 24 und 28 etabliert werden. Die entschützten Produkte wurden mit einer Ausbeute von 44 % bzw. 74 % isoliert und mit dem Thioester 18 zu den RNasen 26 und 30 ligiert. Nach einer Rückfaltung der synthetischen Proteine konnte mit einem Assay deren Aktivität nachgewiesen werden. Diese Erkenntnisse konnten zur Synthese der kompletten RNase 1-124 34 mit einem Nonasaccharid an Asn34 angewandt werden. Die Isolierung des entschützten Ligationsproduktes 33 aus der Reaktion von RNase 40-124 3 mit dem Glycopeptidthioester RNase Thz-26-39 31 gelang mit einer Ausbeute von 48 %. Das Produkt wurde mit 18 zur Reaktion gebracht und zurückgefaltet. Nach Reinigung mittels Gelfiltration konnte das native Enzym 34a in einer Ausbeute von 71 % gewonnen werden. Die RNase-Aktivität des synthetischen Glycoproteins 34a wurde durch Vergleich mit der Aktivität von RNase A mit einem kcat/Km-Wert von 9.6 x 102 M-1 s-1 bestimmt (RNase A = 5.6 x 103, RNase B = 1.5 x 103 M-1 s-1). In dieser Arbeit konnte eine reproduzierbare Methode zur molekularbiologischen Gewinnung von Fragmenten mit N-terminalem Cys etabliert werden. Mit Hilfe eines rekombinanten RNase-Fragmentes und den entprechenden Thioestern bzw. Glycopeptidthioestern konnte erstmals ein biologisch aktives, homogenes RNase-Glycoprotein mit komplexem N-Glycan erhalten werden. Diese Strategie sollte auf die Synthese von biochemisch und therapeutisch interessanten Proteinen übertragbar sein.
-
Ausrichtung von Blockcopolymerfilmen im Elektrischen Feld: Eine In-Situ Rasterkraftmikroskopische Untersuchung
(2007)
-
Violetta Olszowka
- Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Reorientierung sowohl von dünnen als auch dicken Diblockcopolymerfilmen mit lamellarer Mikrodomänenstruktur im realen Raum untersucht. Die Experimente erfolgten unter Tempern im Lösungsmitteldampf im planaren elektrischen Feld. Es wurden zwei Wege gezeigt, wie lamellare Mikrodomänen aufgestellt und durch ein elektrisches Feld in drei Dimensionen ausgerichtet werden können. In beiden Fällen wurden periodische und hochgeordnete Streifenstrukturen erhalten. Sowohl der Reorientierungsmechanismus der Mikrodomänen als auch der Einfluss des elektrischen Feldes auf die Defektbeweglichkeiten im dünnen Film, wurden mit einem modifizierten AFM, dem so genannten quasi in-situ AFM untersucht. Der Mechanismus der Reorientierung im dicken Film wurde durch eine kombinierte Studie aus AFM, GISAXS, REM und in-situ Ellipsometrie ermittelt. Weiterhin wurden der Verlauf der elektrischen Feldlinien und die Feldstärke für die verwendete Elektrodengeometrie auf der Basis der Finiten-Elemente-Methode simuliert. Ferner wurde der Einfluss des elektrischen Feldes auf den Grad der Ausrichtung für die Polymere SHM und SV untersucht. Hierfür wurden kombinatorische Experimente mit Elektroden in Gradientengeometrie durchgeführt.
-
A Continuum Electrostatic Approach for Calculating The Binding Energetics of Multiple Ligands
(2007)
-
Timm Essigke
- Complex biomolecules like proteins or nucleic acids can transiently bind various ligands, e.g., electrons, protons, ions or larger molecules. This property is the key to enzymatic catalysis, regulation and energy transduction in biological systems. Interactions between different ligand binding sites can lead to complex titration behaviors, which can be explained based on a microstate description of the system. Previous approaches to calculate the binding behavior of multiple ligand, only treated sites with one or no ligand bound by using a binary state vector to describe the system. Also only one or two ligand types, i.e., protons or electrons, were used for the calculation. In this thesis, I derive a more general formulation of the theory of ligand binding to biomolecules. For each site any number of charge forms and rotamer forms are allowed as well as any number of ligands and any number of ligand types can be bound. Charge and rotamer forms of sites can be parameterized by measurements on model reactions in solution or by quantum chemical calculations. An energy function is described, consistently combining experimentally determined contributions and those, which can be calculated by continuum electrostatics, molecular mechanics and quantum chemistry. Programs (i.e., QMPB and Perl Molecule) were developed to perform calculations based on the generalized ligand binding theory. The class library Perl Molecule was developed to write powerful Perl programs, which perform the necessary processing steps, e.g., for the conversion of a pdb-file into the input required for energy calculations. The generated input contains all experimentally determined or molecular mechanically and quantum chemically obtained parameters. The energy calculations are performed by the program QMPB, which uses other programs for the continuum electrostatics calculations to solve the linearized Poisson-Boltzmann equation. The computations scale linearly with the total number of sites of the system and can easily be performed in parallel. From the obtained energies, microscopic ligand binding probabilities can be calculated as function of chemical potentials of ligands in solution, e.g., by a Monte Carlo program. Additionally, microscopic and macroscopic equilibrium constants can be computed. The usefullness and correctness of the new approach based on a generalized ligand binding theory is demonstrated by a number of studies on diverse examples. Because various groups used Lysozyme as benchmark system for continuum electrostatics, it is chosen to test if previously obtained results can be reproduced with QMPB. Different quantum chemical approaches are applied to the benzoquinone system for parameterizing a site with several protonation and reduction forms. A complex site is also the CuB center in Cytochrome c oxidase, which is studied to decide if multiple protonation forms of the coordinating histidines are involved in the reaction mechanism. Factors influencing the reduction potential of the electron transfer protein ferredoxin are analyzed using the programs Perl Molecule and QMPB. Here, in particular conformational changes of a peptide bond in the vicinity of the [2Fe-2S] center are of interest. The protonation form of a neighboring glutamate turns out to influence the reduction potential strongly. Protonation and phosphorylation studies on the protein HPr lead to the development of a four-microstate model to explain conformational changes on a histidine, which can be observed by experiment, molecular dynamics simulation and electrostatic calculations. The phosphorylation and protonation state dependent conformational change can be related to the dual role of the protein in regulation and phosphate-transfer. The new microstate description does not only allow to analyze thermodynamic properties but also paved the road for the study of the kinetics of charge transfer.
-
Katalysatordesign als Beitrag zu einer nachhaltigeren Chemie
(2007)
-
Sebastian Proch
- Aminopyridine bzw. Dipyridylamine können durch Monochlorphosphane, wie z.B. Chlordiphenylphosphan, funktionalisiert werden und es entstehen neutrale P,N-Chelatliganden. Diese P,N-Liganden können Palladiumvorstufen für die Suzukikreuzkupplung stabilisieren. Ein besonderer Vertreter [Bis(2-pyridyl)amino]diphenylphosphan bildet mit Rhodium-1,5-cyclooctadien-chlorid-dimer einen homobimetallischen Komplex, welcher sich als Katalysator für die Direktarylierung nichtaktivierter Arene eignet. In einer homogenkatalytischen Reaktion kann hierbei z.B. 3-Chlorpyridin mit Benzol zu 3-Phenylpyridin gekuppelt werden, jedoch sind die eingesetzten Katalysatoren nicht rezyklierbar. Rezyklierbare Katalysatoren für Kreuzkupplungen können aus Palladiumnanopartikeln aufgebaut werden, um eine Filtrierbarkeit der Nanopartikel zu gewährleisten müssen diese auf einem entsprechenden Trägersystem immobilisiert werden. Dazu werden sphärische Polyelektrolytbürsten (SPB) verwendet, welche ein robustes Trägersystem darstellen. Die Anwendung dieses Verbundsystems in der Heck- und Suzukikreuzkupplung liefert eine exzellente Rezyklierbarkeit und ein Auslaugen des Katalysators von nur 6 ppm in das gebildete Produkt. Die Breite an Metallnanopartikeln auf SPB-Träger kann vergrößert werden, z.B. Gold, Platin, Rhodium; dabei können auch bimetallische Partikel hergestellt werden. Diese neue Breite an Metallen liefert den Zugang zu weiteren Reaktionen, die katalysiert werden können. Dabei ist besonders die Oxidation von Alkoholen zu Aldehyden oder Ketonen bei Raumtemperatur mit Luftsauerstoff in Wasser interessant. Sie stellt eine umweltfreundliche Alternative zur industriell verwendeten Oxidation mit äquimolaren Mengen an Chrom- oder Manganreagenzien dar. Durch die Nanopartikelfunktionalisierung eignen sich SPB-Verbundsysteme auch als Wasserstoffspeichermedien bei Raumtemperatur („spillover“), es können bis zu 2 wt% an Wasserstoff gespeichert werden. Überträgt man den gleichen Ansatz auf mikro- bis mesoporöse Feststoffe (MOF-5, Silica) und funktionalisiert diese mit Palladiumnanopartikeln, so erhält man Speicherkapazitäten von bis zu 6 wt% an Wasserstoff.
-
Development of Molecular Glasses for Solvent-Free Photolithography utilizing Combinatorial Vapor Deposition
(2007)
-
Frauke Pfeiffer
- This thesis is concerned with solvent-free film preparation of low molecular weight, amorphous, photosensitive resists by physical vapor deposition (PVD), their subsequent UV exposure through a mask and their development to produce features in the micro- and nanometer range. In the frame of the thesis towards a solvent-free lithography, the combinatorial PVD techniques developed in our group allow the exact preparation of gradients or sectors on the same substrate as well as the coevaporation of several substances. Whilst evaporation, different masks can be positioned between the sources and just below the substrate so that the material deposit only within defined sectors of the substrate. By doing so, a so-called sector library with various sectors with different compositions on the same substrate and in one sequence without breaking the vacuum or opening the PVD chamber can be created. In the thesis, two types of low molecular weight, negative tone photoresists were investigated: 1.) Research was carried out on molecular glass photoresists which consist of several components. One of these components, a photoacid generator (PAG), generates acid molecules when exposed to suitable wavelengths. In a post-exposure bake, the formed protons catalytically initiate reactions between the other resist components (chemical amplification). Investigations and characterizations (DSC, TGA, HPLC) were performed on the suitability of various low molecular weight chemically amplified resist (CAR) materials for film deposition via PVD as well as subsequent photolithography processes. Three ternary systems were identified to accomplish the requirements (vapor depositability, formation of glassy films, photostructurability). Each of them consists of a molecule with several phenolic groups, an acid labile crosslinker, and a PAG. By utilizing the combinatorial mask technique of the PVD facility, sector libraries were prepared to optimize the composition of each of the CARs. The exposure dose was also combinatorially optimized by irradiating each of the created sectors with different doses of 365 nm UV light. Additionally, development conditions like dilution and time were optimized. Interestingly, it was found that two resists can be developed with pure water which is a step towards more environmentally friendly processes. With the employed equipment, features with a resolution of 400 nm could be realized. HPLC analysis was utilized to determine the thermal stability of investigated substances and the compositions in the prepared sectors. 2.) Newly synthesized, self-reactive coumarin derivatives were explored in regard to their suitability for an all-dry photolithography process. When exposed to wavelengths above 300 nm, many coumarin derivatives undergo a [2+2] cycloaddition. Depending on the number of functional coumarin groups, dimers, chains, or networks can be generated by this photoreaction. The ten coumarin esters presented in this thesis were, except for one, newly synthesized and characterized by NMR spectroscopy, HRMS, elemental analysis, DSC, and TGA. They were synthesized in respect of requirements regarding photoresists and PVD, e.g. glass-forming properties, and thermal stability. Several of the synthesized esters could be evaporated without decomposition. Two esters, 1,3-dibenzoic-5-tert-butylcoumarinester und 3,5-di-tert-butylbenzoiccoumarinester, produced the desired amorphous and thus transparent films. Since the monomers preferably reform when the irradiated product is exposed to wavelengths below 300 nm, irradiation only above this critical wavelength was employed. This circumstance lead to long exposure times of 50 min because of the small overlap between the absorption spectra of the coumarin derivatives and that of the lamp. The successful employment of a sensitizer which could be coevaporated with 3,5-di-tert-butylbenzoiccoumarinester reduced the necessary exposure dose significantly from 50 to 5 min. Since the above described coumarin derivative monomers evaporate in high vacuum, a dry development through the removal of the unexposed monomers by thermal treatment under high vacuum in a self-made facility was also investigated. One of the two vapor-depositable and glass-like monomers, monofunctional 3,5-di-tert-butylbenzoiccoumarinester, could be removed completely by thermal treatment under high vacuum. By doing so, an all-dry photolithography with a low molecular weight coumarin ester could be established. It was shown that a dimerization is sufficient to create an ample difference in melting points for a dry development. In summary, this thesis proved the concept of PVD for the solvent-free preparation of low molecular weight, glassy photoresist films. The application of a newly synthesized coumarin derivative as a negative tone, low molecular weight photoresist allowed an all-dry photolithography, and was realized for the first time for this substance class.
-
Glasbildende Sternmoleküle für photoschaltbare cholesterische Phasen
(2007)
-
Rüdiger Ulbrich
- Die vorliegende Arbeit beschreibt photoschaltbare cholesterische Phasen. Die cholesterische Struktur kann durch Zumischen einer chiralen Verbindung zu einer nematischen Phase induziert werden. Der Anteil des zugegebenen chiralen Hilfsstoffes bestimmt dabei die Ganghöhe der cholesterischen Helix und damit die Reflexionswellenlänge, denn eine herausragende Eigenschaft von cholesterischen Phasen ist die selektive Reflexion von zirkularpolarisiertem Licht. Befindet sich nun die Ganghöhe im Bereich des sichtbaren Lichtes, dann können farbige Proben erzeugt werden. Die Farbe des reflektierten Lichtes ist auch abhängig vom Betrachtungswinkel. So verschiebt sich die Wellenlänge mit zunehmender schräger Betrachtung zu kürzeren Wellenlängen. Dieses Verhalten wird auch als „Farb-Flop“ bezeichnet. Photoschaltbare cholesterische Phasen erhält man, indem zusätzlich photochrome Verbindungen zugemischt werden. Das chirale und das photochrome Element können auch in einem Molekül vereint sein. Ebenso kann der Flüssigkristall bereits cholesterisch sein, sodass das Zumischen der chiralen Komponente entfällt. Unabhängig davon, wie die cholesterische Phase erzeugt wird, muss auf jeden Fall ein photochromes Element vorhanden sein. Wird nun die cholesterische Phase mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt, dann führt dies beim Photochrom zu einer Isomerie, z. B. trans-cis-Isomerie. Die dadurch veränderte Molekülgeometrie wiederum führt, im Falle einer chiral-photochromen Verbindung, zu einer Veränderung der helikalen Ganghöhe und damit der Reflexionsfarbe, da sich die Verdrillungsstärken der zwei Isomere unterscheiden. Über die Belichtungszeit kann nun das Ausmass der Isomerie und damit die Farbe der Probe gesteuert werden. Damit sich die bestrahlten Bereiche nach der Belichtung nicht mehr verändern können, ist eine Fixierung nötig. Dazu können die verwendeten Moleküle mit polymerisierbaren Gruppen versehen werden. Durch die Polymerisation resultiert ein Polymernetzwerk, das aber auch keine nachträgliche Änderung der cholesterischen Phase mehr zulässt. Soll jedoch eine nachträgliche Veränderung möglich sein, dann muss die Fixierung der helikalen Struktur durch Abkühlen einer glasbildenden Matrix unter die Glasübergangstemperatur erfolgen. Bei einer auf diese Weise fixierten cholesterischen Phase kann dann bei Temperaturen oberhalb des Glasübergangs die helikale Ganghöhe durch Isomerisierung des Photochroms verändert werden. Eine glasbildende flüssigkristalline Matrix kann erhalten werden, wenn mehrere mesogene Einheiten über einen flexiblen Spacer miteinander zu Sternmolekülen verknüpft werden. Denn von Sternmolekülen ist bekannt, dass bei ihnen die Kristallisation aus sterischen Gründen gehindert ist und ein stabiler Glaszustand möglich ist. Daher wurden ausgehend von den Ergebnissen von T. Pfeuffer [133, 142] verschiedene Sternmoleküle synthetisiert, von denen zwei für die Verwendung in photoschaltbaren cholesterischen Phasen geeignet sind. Als photochrome Dotierstoffe wurden neben achiralen 4,4’-Dialkylazobenzolen 1 – 6 auch zwei chirale Menthon-Derivate 27 und 28 hergestellt. Sowohl die 4,4’-Dialkylazobenzole als auch die Menthon-Derivate können mit UV-Licht (~365 nm) isomerisiert werden. Dies führt zu der angesprochenen Geometrieänderung, die wiederum die helikale Ganghöhe verändert und damit zu einer veränderten Reflexionswellenlänge führt. Die Re-isomerisierung ist im Fall der Azobenzole sowohl thermisch als auch photochemisch (> 420 nm) möglich. Die Menthon-Derivate dagegen können nur thermisch re-isomerisiert werden. Bei den Menthon-Derivaten 27 und 28 sind chirales und photochromes Element in einem Molekül vereint und die photochrome Reaktion findet sehr nah am chiralen Zentrum statt. Die Isomerisierung der Doppelbindung führt zu einer um den Faktor 10 kleineren Verdrillungsstärke, wofür die Methylgruppe des Menthons hauptsächlich verantwortlich ist. Für eine hohe Verdrillungsstärke muss sie sich genau an dieser Position befinden und zusätzlich auch (R)-konfiguriert sein. Die Bestrahlung mit UV-Licht führt nun dazu, dass die Methylgruppe ihre Position zum Aromaten verändert und bewirkt dadurch den Verlust der hohen Verdrillungsstärke des Menthon-Derivates. In dieser Arbeit konnten drei cholesterische Phasen entwickelt werden, bei denen durch Bestrahlung des chiralen Photochroms mit UV-Licht die Reflexionswellenlängen vom kurzwelligen zum langwelligen sichtbaren Spektralbereich verschoben werden können. Die Schaltzeiten der Systeme 1 und 2 sind deutlich kürzer als die von vergleichbaren polymeren Systemen, die bis zu 160 Minuten betragen können. Ebenso konnte durch den Einsatz der glasbildenden Sternmoleküle die Stabilität der flüssigkristallinen Phasen verbessert werden, da den meisten niedermolekularen Systemen die fixierende Eigenschaft der flüssigkristallinen Matrix fehlt und daher die eingeschriebenen Informationen bereits nach 20 Minuten bis 48 Stunden meist wieder verloren gehen.
-
Star-shaped Polyelectrolytes
(2007)
-
Felix Plamper
- Star-shaped polyelectrolytes were prepared by means of atom transfer radical polymerization (ATRP) utilizing the core-first approach. Star-shaped poly(acrylic acid) (PAA) with 5, 8 and 21 arms and different arm lengths was prepared via the corresponding poly(tert-butyl acrylate) (PtBA) precursors having a glucose, saccharose or beta-cyclodextrin core. Adopting the attempt for preparation of PAA we used the same scaffolds for the preparation of star-shaped poly(dimethylaminoethyl methacrylate) (PDMAEMA). It is a weak cationic polyelectrolyte and it can be easily transformed to a strong one by quantitative quaternization (with methyl iodide) leading to poly{[2-(methacryloyloxy)ethyl] trimethylammonium iodide}, PMETAI). In order to reach high arm number a novel, hybrid silsesquioxane initiator with 58 initiation sites was introduced. The solution behavior of the obtained PAA stars was analyzed. Potentiometric titrations indicate a decrease of PAA’s acidity when increasing the arm number whereas a slight increase of the acidity was observed when increasing the molecular weight by increasing the length of the arms at constant arm number. The results are explained by the higher segment density of samples with short arms and high arm numbers, leading to a pronounced osmotic pressure inside the stars due to the presence of counterions. The osmotic pressure opposes further deprotonation, resulting in a decreased acidity. The osmotic coefficient decreases with increasing arm number, indicating higher counterion confinement within structures with higher branching. The use of strong polyelectrolytes facilitates the determination of the osmotic coefficient. It was seen directly that increasing arm numbers and decreasing arm lengths lead to a decrease of the osmotic coefficient. The osmotic coefficients of the investigated stars are in the range from 0.03 to 0.13, indicating the strong counterion confinement. Theory and experiment meet in the same order of magnitude. However the concentration dependence predicted by theory is not rendered by the experiment. The size of PMETAI stars in solution was investigated by dynamic light scattering (DLS), showing the expected collapse of the stars with increasing ionic strength. Electrostatic and osmotic screening leads to a retraction of the originally stretched arms, when no additional salt is present. However ion-specific effects lead to a more pronounced shrinkage when sodium chloride was exchanged with sodium iodide. The considerable osmotic pressure inside the star helps to incorporate multivalent counterions. The ion exchange reduces the number of counterions within the star, simultaneously increasing the translatory entropy of all counterions, since a multiple number of monovalent counterions is released into bulk for one multivalent counterion, which has been incorporated. The ion exchange leads to a decrease in osmotic pressure inside the star, reducing the strong stretching of the polymer’s arms, as seen by DLS. The collapse is more pronounced for counterions of higher valency. The switching of the counterion’s charge can therefore lead to smart polyelectrolytes. This was seen for the trivalent, light-sensitive hexacyanocobaltate(III), which by UV illumination transforms to a divalent counterion. Simultanously the hydrodynamic radius increases upon irradiation. Finally the thermoresponsive properties of aqueous solutions of star-shaped PDMAEMA were investigated. PDMAEMA is both pH-sensitive as temperature-sensitive, showing a miscibility gap at higher temperatures (LCST behavior). PDMAEMA shows a typical Flory-Huggins behavior irrespective to polymers architecture at high pH (in buffer), where it is virtually uncharged. Charge density starts to account for the deviations from ideal Flory-Huggins behavior at intermediate pH. The presence of multivalent ions leads in buffered solutions of PDMAEMA to the appearance of a miscibility gap at low temperatures (UCST behavior). In salt-free solutions the electrostatic stabilization is especially pronounced for polymers with high arm numbers (having higher charge density). No macroscopic demixing was observed for polymers with more than 9 arms.
-
Micelles and Interpolyelectrolyte Complexes formed by Polyisobutylene-block-Poly([meth]acrylic acid) - Synthesis of Polymers and Characterization in Aqueous Solutions
(2007)
-
Markus Burkhardt
- In this work PIB-b-PMAA copolymers with low PDI were studied, which self-assemble in aqueous solutions. A wide range of hydrophobic and hydrophilic block lengths were synthesized via combination of cationic an anionic polymerization. The data we have obtained by means of SANS and DLS point to an interesting dynamic behaviour of such micelles reacting on external stimulus of changes in pH from 10 to 7 and 5 respectively. The response is not only related to a change of the degree of neutralization of the PMAA block in the corona. Quantitative evaluation of SANS curves also shows a change of the size of the hydrophobic core formed by the PIB blocks, due to a change of the aggregation numbers. From cryo-TEM, a spherical shape of the micelles is clearly seen. This allows us to evaluate the SANS data using a model of a spherical particle with protruding arms. Evaluation of the SANS curves evidences about changes in Nagg with pH and with ionic strength. The higher the pH is, the more the arms of the micelle repel their neighbours and the higher the area at the core-corona interface of the micelle is. This leads to decreasing values of Nagg with rising pH. An increase in ionic strength has an opposite effect, resulting in higher Nagg upon improving screening of the charges of the PMAA. DLS measurements also show the response of the corona of the micelle on external stimuli. In principle, the PMAA block is more stretched the higher the number of charges on the arms of the micelles are. This also leads to an increasing Rh. Here the hydrophilic block dominates the response of the aggregate. For DLS, the influence of the PIB core and therefore the changes in Nagg can be neglected due to the longer PMAA block compared to the PIB block of the copolymers used in this work. Potentiometric titrations also show an effect of the ionic strength on the apparent pKa value, shifting it to lower values with increasing cNaCl, while the length of the hydrophilic block seems to play a minor role. For the evaluation of the cmc for different diblock copolymers the PIB block determines the properties of the micellar assemblies as well. The cmc clearly depends on the length of the hydrophobic PIB block. The longer the block is, the lower the cmc is found to be. Additionally a detailed investigation of IPECs formed by PIB-b-PMAA with P4VPQ is presented. The PIB-b-PMAA described above, are used to form water-soluble complexes with core-shell-corona structure. From cryo-TEM images, a spherical shape of the IPECs can be concluded. Slight differences in the overall shape of the complexed micelle give a hint on the proposed structure. The process of formation of complexes can be subdivided in a kinetically driven and a thermodynamically driven process. Upon addition of the polycation to the micellar PIB-b-PMAA solution, first an increase in turbidity of the solution can be observed. In this kinetically driven regime, large assemblies of micelles are formed. With time, these aggregates are equilibrating toward the thermodynamically more stable species of a single micelle with a complex species formed around the hydrophobic PIB core. The formation process can also be seen by means of SANS, leading to higher scattering intensity with increasing Z. SANS was used to follow the salt-induced dissociation of the complex as well. Increasing ionic strength of the IPEC solution leads to a release of the polycation, starting from about 0.2 M NaCl. Beyond 0.6 M NaCl, almost no difference in scattering behaviour of the IPEC solution compared to pure micelles can be stated. This suggests a total dissociation of the IPEC. By means of titration with a sodium selective electrode, the decrease of the activity of the Na ions can be explained by substitution of the polycation due to Manning condensation. Additionally the influence of point of time of addition of salt to an aqueous solution of a new diblock copolymer, PIB-b-PAA, is presented. By means of cryo-TEM, DLS and SANS an effect on the shape of the particles formed in solution could be obtained, whether the salt was added before dissolution (BD) or after dissolution of the polymer (PD). For the BD samples, a high PD of the particles can be seen from in cryo-TEM. Additionally sedimentation of a certain part of the polymer is another hint on larger aggregates. For the PD samples, spherical micelles with a core-corona structure are visible. According to cryo-TEM, their PDI is quite low. This suggests that interparticle exchange of unimers between the micelles is possible, at least before addition of the NaCl. Furthermore, it was shown, that changing the counterion to the "softer" Cs still allows the formation of equilibrium structures for BD samples, as seen from the spherical structure in cryo-TEM images. The influence of solvent for the SANS samples leads to a similar scattering behaviour for all measured samples.
-
The Ab Initio Calculation of the Chemical Shift Tensor and its Application for the Structure Determination in Ordered and Disordered Phases by Means of Solid-State Nuclear Magnetic Resonance
(2007)
-
Jan Sehnert
- The intention of this work was the application of modeling to condensed solid-state systems for the sake of the structure determination and prediction. Besides structural modelling this included the ab initio calculation of the chemical shift tensor which was taken for the simulation of various solid-state NMR experiments and the comparison to NMR measurements. In this context it was necessary to create a tool which could deal with the analysis of spin systems from arbitrary ab initio calculations. This was accomplished by the development of the Gau2Sim program library. The application of the included functions to a chemical shift tensor yields the isotropic chemical shift and the anisotropic information in its two established conventions, either expressed via the anisotropy and the asymmetry parameter or via the span and the skew. Additionally the tensor orientation as given by the three Euler angles can be extracted. On the base of this tool the combined approach of structural and NMR modeling was applied to the structure determination in a broad range of disordered, semi-ordered and fully crystalline phases. These systems varied from phases comprising of isolated molecules over hydrogen bonded molecular as well as polymeric phases to covalently bonded two-dimensional layered compounds. For the structural modeling in these environments the advantages of force field and semiempirical methods, density functional and perturbation theory calculations were combined with the description of the systems in the cluster or embedded cluster approach as well as with calculations under periodic boundary conditions. Such it was possible to directly validate structure proposals from diffraction measurements or to screen the structure of yet unknown phases on a broad range. In the latter case low level methods like force field or semiempirical calculations prove especially useful and could serve as a source for the extraction of unit cells from molecular clusters for purpose of calculations under periodic boundary conditions thereby interconnecting both techniques. The NMR properties of the phases were investigated in minimal structure models in this process testing all parts of the chemical shift tensor for their applicability for structure elucidation. Its easiest measurable parameter is the isotropic chemical shift which successfully was used for an interconnection between NMR experiments and structure models. It served well for the purpose of structure verification and in the case of extended 2D layered systems the impact of random local distortion on the chemical shift spectra could be predicted. However, in addition to that the anisotropic part of the NMR tensor could be used to distinguish between different molecular conformers and similar hydrogen bonding environments. Especially in polarizable moieties such as pi systems the anisotropy of the chemical shift is large enough to be evaluated. It proved to be sensitive to the local structural arrangement as well as the electronic environment of the spins. In a test case it could even be shown that the sensitivity of the carbonyl 13C tensor in a hydrogen bridge is large enough to predict the C=O...H-N arrangement through the analysis of theoretical calculated NMR hypersurfaces with the anisotropic parameters from NMR measurements. The most difficult information to analyze is the tensor orientation. This was was done by the measurement of 2D rf-driven spin-diffusion spectra for a 13C isotope labeled system. Through the simulation of 2D patterns on the base of theoretical structure models it was then possible to gain insight about the conformational arrangement of molecules in a disordered environment. Even though elaborate this methodological approach yielded highly detailed information about the local as well as intermediate structure of the solid state which was not available with any other method. An advantage of the method is that it can be applied to ordered and disordered phases alike. This work clearly shows the power of the combination of solid-state NMR measurements with theoretical modeling of the structure and the NMR chemical shift tensor. For future projects the presented Gau2Sim tools provide the basis for a routine analysis of theoretical NMR calculations and a subsequent simulation of spectra which can be compared to arbitrary NMR experiments.
-
Die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus des Gen-3-Proteins filamentöser Phagen für die Infektion von Escherichia coli
(2007)
-
Barbara Eckert
- Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Bedeutung der Stabilität und des Faltungsmechanismus eines Proteins für dessen Funktionsweise in vivo zu untersuchen. Als Modellsystem diente der filamentöse Phage fd, der Gram-negative Bakterien infiziert. Das Gen-3-Protein (G3P) dieses Phagen ist für die initialen Schritte der Infektion essentiell. G3P ist aus drei Domänen aufgebaut, wobei die C-terminale Domäne das Protein in der Phagenhülle verankert. Die beiden N-terminalen Domänen N1 und N2 bilden eine strukturelle Einheit und wechselwirken mit den beiden zellulären Phagenrezeptoren, dem bakteriellen F-Pilus und TolA in der Zellmembran. Die Wechselwirkung der N2-Domäne mit der Pilusspitze führt zur Dissoziation der beiden Domänen und aktiviert so G3P für die anschließende Interaktion der N1-Domäne mit der C-terminalen Domäne von TolA. Die TolA-Bindungsstelle befindet sich auf N1 an der Domänengrenzfläche und ist deshalb im nativen Ruhezustand des Proteins durch N2 blockiert. Im Verlauf der Infektion muss nach der Pilusbindung die geöffnete, aktive Form des G3P so lange erhalten bleiben, bis N1 mit TolA wechselwirken kann. Die Analyse des Faltungsmechanismus des N1N2-Fragments in vitro zeigte, dass die beiden Domänen N1 und N2 sehr schnell falten, ihre Assoziation im letzten Rückfaltungsschritt jedoch außergewöhnlich langsam ist. Die Geschwindigkeit der Domänenassoziation wird durch die trans-nach-cis-Isomerisierung an Pro213 bestimmt, das in der Gelenkregion zwischen den beiden Domänen lokalisiert ist. Die Isomerisierung in den nativen cis-Zustand ist mit einer Zeitkonstante von 6200 s (bei 25 °C) sehr viel langsamer als Prolinisomerisierungen in anderen Proteinen und wird durch die lokale Sequenzumgebung um cis-Pro213 (Gln212-Pro213-Pro214) verursacht. Die Relevanz der langsamen Prolinisomerisierung für die Phageninfektiosität konnte in Kompetitionsexperimenten nachgewiesen werden. In diesen Experimenten konkurrierten jeweils zwei Phagenvarianten, die sich in ihrer Isomerisierungsrate und damit der Assoziationsrate der beiden Domänen unterschieden, um die Infektion einer E. coli-Kultur. Phagen, die eine langsame Prolinisomerisierung und damit eine lange Lebensdauer des aktiven, geöffneten Zustands mit dissoziierten Domänen aufweisen, setzten sich in den Kompetitionsexperimenten durch. Dass es sich bei der Inaktivierung der Phagen tatsächlich um einen prolinkontrollierten Mechanismus handelt, zeigte der Einfluss der Prolylisomerase Cyp18. Nach Dissoziation der Domänen kontrolliert also die langsame trans-nach-cis-Isomerisierung die Lebensdauer des infektiösen Zustands. Die Infektion von F--Zellen mit in vitro aktivierten Phagen ermöglichte es, die Lebensdauer des aktiven Zustands und die Kinetik der Inaktivierung der Phagen zu bestimmen. Die für verschiedene Phagenvarianten erhaltenen Zeitkonstanten spiegelten dabei die Isomerisierungskinetik des entsprechenden G3P-Proteins in vitro wider. Die langsame Prolinisomerisierung in der Gelenkregion steuert so die Funktion des G3P bei der Phageninfektion, indem Pro213 sowohl als Schalter als auch als Zeitgeber wirkt. In der nativen cis-Konformation steht dieser Schalter auf „aus“, die beiden Domänen N1 und N2 sind fest miteinander assoziiert und die Gelenksubdomäne liegt gefaltet vor. Entsprechend sind die Phagen in dieser Ruheform stabil, aber nicht infektiös. Die Bindung der N2-Domäne an den F-Pilus führt zur Dissoziation der beiden Domänen. Mit Hilfe CD-spektroskopischer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in diesem offenen, aktivierten Zustand entfaltet vorliegt. Dies führt zu einer Destabilisierung der N2-Domäne. Ob N2 bei der Infektion ebenfalls entfaltet vorliegt, konnte jedoch nicht gezeigt werden. Als Folge der partiellen Entfaltung der Gelenkregion isomerisiert Pro213 aus dem sterisch anspruchsvollen cis- in den stabileren trans-Zustand, welcher der „an“-Stellung des Prolinschalters entspricht. Die sehr langsame Rückisomerisierung in die native cis-Konformation fungiert nun als Zeitgeber und gewährleistet, dass G3P lange genug geöffnet und partiell entfaltet bleibt, um eine Wechselwirkung zwischen der N1-Domäne und TolA in der Zellmembran zu ermöglichen. Neben dem Faltungsmechanismus beeinflusst auch die Stabilität des G3P die Infektiosität der Phagen. Mit Hilfe von Infektionsexperimenten von F+- und F--Zellen konnte gezeigt werden, dass die Infektiosität stark von der Stabilität des G3P, insbesondere von der Stärke der Domäneninteraktion, anhängt. Mit zunehmender Stabilität nimmt die Infektiosität ab, und stabilisierende Mutationen erschweren den Übergang in die aktive, partiell entfaltete Form mit dissoziierten Domänen. Die Stabilität des G3P ist daher so angepasst, dass einerseits eine Stabilität der Phagen im Ruhezustand garantiert ist, und es andererseits bei Bindung an den F-Pilus durch Domänendissoziation aktiviert werden kann.
