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Modeling Pattern Formation in Biopolymer Systems induced by Reaction Kinetics and Molecular Motors
(2006)
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Falko Ziebert
- In my thesis I studied pattern formation in nonequilibrium (NE) polymer systems motivated from cell biology. Actin and microtubules (MTs) can be met in a state of continuous de-/polymerization (D/P), which is used by the cell e.g. during locomotion. This is a NE state since the polymerization is actively coupled to ATP or GTP hydrolysis. A second NE state of biological relevance is caused by motor proteins. These are mobile crosslinkers that walk on the filaments whereby creating forces and reorienting or transporting the latter. The cell displays filament-related ordered structures like aster patterns in the mitotic spindle, bundles in actin stress fibers and also oscillating structures e.g. in muscle bundles. The question is to what extent these structures inside the cell are governed by the physics of active polymers. In part I of my work, we proposed a pattern forming mechanism in a filament solution at high density that is subject to a D/P state. Since actin and MTs are rod-like objects, at high filament concentration a transition to lyotropic nematic order occurs. This transition is first order and thus accompanied by a phase separation. In the absence of D/P kinetics, the solution will thus tend to decompose into an isotropic domain with low density and a domain of high density and nematic order, i.e. the filaments preferentially aligned in one direction. To highlight that the D/P process interplays with this transition, we assumed that filaments are generated and decaying with some specific rates, implying a finite lifetime for the filaments. Accordingly the latter can only diffuse a finite length during their lifetime, which competes with the tendency of the system to phase separate and gives rise to a finite wavelength instability towards a pattern with alternating isotropic and nematic regions with a wavelength of the order of 10 microns. The model developed to describe these patterns is also interesting since it allows a feasible linear stability analysis of the homogeneous nematic state. Part II is devoted to the NE interaction of motor proteins with the filaments. As the starting point of our modeling efforts we chose a mesoscopic approach, namely a Smoluchowski equation which can be coarse-grained to obtain equations for the density and the orientation of the filaments. The main difference to a passive solution of rods are active motor-mediated currents caused by a motor density assumed sufficiently high and homogeneously distributed. These active contributions can be determined to leading order, introducing phenomenological motor transport rates containing details like active motor density, duty ratio, etc. After a thorough linear analysis of the model we obtained a rich instability diagram with an orientational finite wavelength instability which is either stationary or oscillatory and a demixing instability similar to spinodal decomposition but also motor-mediated. The finite wavelength instability has been analyzed by perturbative techniques and numerical simulations of the model equations. In the stationary case, we calculated the existence and stability regions of stripes and squares, which could be related to bundle-like structures and regular lattices of asters respectively. In the oscillatory case, there is competition between traveling and standing waves in one dimension and between traveling and alternating waves in two dimensions, the latter being a four mode solution built from two standing waves in perpendicular directions with a phase shift of 90 degrees. The long-wavelength demixing instability has also been investigated, showing coarsening aster-like structures. Experiments on MT-motor solutions display dissipative patterns in the NE state. Recent experiments on actin filaments and myosin oligomers show a rather different behavior, namely cluster patterns do not appear until ATP is nearly depleted. We proposed two mechanisms to explain these patterns: first, motors lacking ATP form rigor bonds with actin inducing small bundles, which through a combination of reduced diffusivity and enhanced interaction cross-section can be transported more efficiently, allowing the system to cross one of the instabilities discussed above. A second important feature is the presence of crosslinking proteins in the experiments. We propose that these can be interpreted as a parametric disorder. Assuming in the model a random contribution to the active current, a Ginzburg-Landau equation with multiplicative stationary noise could be derived leading to a threshold reduction. To conclude, it seems to be fruitful to apply and combine methods from statistical physics and pattern formation to NE problems in cell biology to foster the understanding of actively polymerizing filament and motor proteins in their different NE states.
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New Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy in Materials Science
(2006)
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Heiko Zettl
- In this work we have developed new concepts for the usage of fluorescence correlation spectroscopy. A classical FCS setup was modified in such a way that fluorescent species in aqueous as well as organic environments can be studied at varying temperature. We have synthesised a set of dye-labelled polymers that served as a well-defined system to study polymer diffusion and that was used to characterise the beam path and focal volume in environments with refractive indices different from that of water. Furthermore a new method for the labelling of ionic species was developed. The adaptation of the microscope optics to non-aqueous environments was done by replacing the present microscope objective by a multi-immersion objective. Secondly, a sample chamber was developed that was not only resistant to organic solvents in all parts but also allowed temperature control of the solution. Determining diffusion coefficients of polymers in solution and their concentrations requires the exact knowledge of shape and size of the observation volume. For this purpose we have synthesised a set of polystyrenes with molecular weights ranging from 4 to 1550 kg/mol each chain being labelled with a single dye molecule. All species were anionically polymerised in order to grant a very low polydispersity and with this a high reliability in the determination of the observation volume. This concept can be transferred to other solvents and, hence, shows an easy way to calibrate fluorescence correlation microscopes to different solvents and to investigate non-aqueous solutions. Furthermore, we have shown exemplarily for polystyrene that FCS is capable of determining the crossover between the dilute and the semi-dilute concentration regime. Dye-labelled polymer chains were mixed with unlabelled polymer chains of the same length and their mobility was measured by FCS for different mixing ratios. The change of the mobilities leads to the respective overlap concentrations, which are shown to follow a scaling law in a range of molecular weights from 4 to 1550 kg/mol. This is in excellent agreement with the predictions made by Flory and Huggins. The data shown demonstrate that FCS can measure diffusion properties in ranges that were not accessible before. Another part of this work focusses on concepts to monitor the aggregation of molecules by FCS. Taking low-molecular-weight surfactants as an example it is shown that with the help of Coulomb interaction cationic surfactants can be labelled with anionic dye molecules and vice versa. Moreover, micelle formation is observed already at concentrations slightly below the critical micelle concentration found with classical methods. This findings are in excellent agreement with the predictions made by Israeliachvili in the 1990ies. Additionally, it was demonstrated that by using insoluble dye molecules, which are incorporated by the forming aggregates, aggregate formation can be followed by FCS on a single-molecule level. This procedure was shown to work in both aqueous and organic polymer solutions. The high sensitivity of FCS permitted to determine the critical aggregation concentration of Janus micelles in THF to the very low value of around 8 mg/L. No other experimental method available today is capable of determining aggregation concentrations in such a low concentration regime. In the same way the critical aggregation concentration of block copolymer polystyrene-Amylose in THF was determined. Finally, temperature-dependent correlation curves allowed the determination of reaction constants and enthalpies. This is of particular interest in biochemical contexts, as the amount of available material can be minute. Exemplarily, the binding enthalpy of an RPA protein to a single-stranded DNA strain is determined by temperature-dependent correlation curves. The modifications made to a classical FCS setup were shown to enhance the spectrum of possible applications to new experimental fields. The methods and concepts developed in the framework of this thesis are expected to play an important role in meeting future challenges of polymer physics and microbiology.
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The Use of Biomarker and Stable Isotope Analyses in Palaeopedology / Reconstruction of Middle and Late Quaternary Environmental and Climate History, with examples from Mt. Kilimanjaro, NE Siberia and NE Argentina
(2006)
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Michael Zech
- Palaeosols are important terrestrial archives for the reconstruction of the Quaternary landscape and climate history. In order to derive reliable information from these archives about sedimentation, vegetation and climate history, various methods and proxies are traditionally applied, e.g. texture analysis, numeric dating methods and mineral analysis. The aim of this dissertation is to evaluate the potential of biomarker and stable isotope analyzes. Specifically, I focused on plant leaf wax-derived n-alkanes, amino acid enantiomers, stable carbon and nitrogen isotopes (d13C and d15N) in bulk soil organic matter (SOM) and on compound-specific isotope analysis (CSIA) of n-alkanes. The respective methods were partly optimized and then applied in multi-proxy analytical approaches to three selected palaeosol records, representing different ecological environments. In all three study areas, long-chain n-alkane ratios, nC31/nC27 and (nC31+nC29)/nC27, respectively, proved to be straightforward biomarker proxies for the reconstruction of the terrestrial palaeovegetation at plant community level (especially grasses and herbs versus trees). Short- and mid-chain n-alkanes (nC17–nC19 and nC20–nC25, respectively) were successfully used for detecting algal- and aquatic macrophyte-derived organic matter (OM) in the sediment core Arg. D4. Amino acid enantiomers as nitrogen (N) biomarkers allowed a further characterization of the SOM in the Tumara Palaeosol Sequence: On the one hand, the depth functions of D/L-aspartic acid (Asp) and D/L-lysine (Lys) could be roughly described by exponential fits, reflecting SOM aging. On the other hand, brown interglacial/-stadial palaeosols generally revealed higher D/L-ratios than dark gray glacial palaeosols. This finding suggests that D/L-aspartic acid and D/L-lysine may serve as palaeotemperature proxies. In the Arg. D4 record, d13C varied in a wide range (from -30.1‰ to -17.4‰), indicating C3-C4 vegetation changes and hence allowing a reconstruction of the palaeovegetation. However, the natural abundance of 13C was no straightforward proxy for the interpretation of the palaeosol sequences on Mt. Kilimanjaro and in the Tumara Valley. There, the interpretation of smaller d13C variations – assumed to be independent of C3-C4 vegetation changes – needed multi-proxy analytical approaches for disentangling the various possibly influencing environmental factors: On Mt. Kilimanjaro, d13C is higher in palaeosols, which developed under ericaceous vegetation (~ -25‰) compared to those developed under tropical montane forests (~ -27‰), suggesting that such vegetation changes are responsible for the observed d13C pattern. In the Tumara Palaeosol Sequence, d13C correlates negatively with total organic carbon (TOC) and TOC/N. As both parameters may serve as proxies for SOM decomposition, it is assumed that degradation processes have contributed significantly to this d13C record. Furthermore, also changing water stress conditions for the plants could have played a crucial role for d13C in the Tumara Palaeosol Sequence. In contrast to d13C, d15N in the Tumara Palaeosol Sequence does not correlate with any of the other SOM characterizing parameters (TOC, TOC/N and d13C). Although other processes than SOM decomposition like (i) denitrification, (ii) N fixation, (iii) N losses by frequent fire events, and (iv) changes in the atmospheric 15N deposition are discussed as factors contributing to an open N cycle, d15N in the Tumara Palaeosol Sequence seems not to be a straightforward proxy. The compound-specific d13C analysis (CSIA) of n-alkanes was optimized and applied to selected samples from the Arg. D4 record. The highly significant correlations of the compound-specific isotope results with bulk d13C corroborate the reliability of the d13C vegetation proxy. Furthermore, the increasing d13C amplitudes from nC27 to nC33 validate the origin of these biomarker molecules, with nC27 and nC29 mainly deriving from C3 trees and shrubs and nC31 and nC33 mainly deriving from C3 or C4 grasses and herbs. Eventually, the multi-proxy analytical approaches (including the innovative biomarker and stable isotope analyzes) enabled detailed reconstructions of the Middle and Late Quaternary palaeoenvironmental changes in the three study areas: Accordingly, the deep black palaeosols on the southern slopes of Mt. Kilimanjaro reflect periods of climatic deterioration during the Last Glacial Maximum (LGM) and the Late Glacial, which coincided with a descent of the ericaceous vegetation belt. The palaeopedologic findings from the Tumara Palaeosol Sequence suggest that the dark gray and brown stratigraphic units of this record describe alternating glacial and interglacial/-stadial periods during the last ~240 ka. The stratigraphic units of the Arg. D4 record were correlated with climatic events on the Bolivian Altiplano and discussed in terms of an intensified palaeo-South American Summer Monsoon (SASM).
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Gating of water channels (aquaporins) in plants: effects of osmotic and oxidative stresses and the role of unstirred layers
(2006)
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Qing Ye
- There is accumulating evidence that water channels (aquaporins; AQPs) play an important role in plant water relations at the levels of cells, tissues, organs, and whole plants. AQPs facilitate the rapid, passive exchange of water across cell membranes. Most of the water permeability of plasma membranes is due to AQP activity, i.e. the open/closed state of AQPs can be ‘gated’ in order to regulate water movement. Many internal (metabolic) factors or external (environmental) stresses have been found to cause a gating of AQPs, but the precise gating mechanisms are not well understood. Using pressure probe techniques, water and solute flows across cell membranes (internodes of giant green alga Chara and of cortical cells of corn root) and across an entire organ (roots of young corn seedlings) were studied. Based on detailed information on the function of AQPs, two new gating mechanisms of AQPs have been proposed. One is the ‘cohesion/tension (C/T) mechanism’ for the osmotic gating of AQPs, which is used to interpret the effect of high concentration on cell hydraulic conductivity (Lp) during osmotic stress. The other one is the ‘oxidative gating mechanism’ of AQPs in the presence of hydroxyl radicals (*OH) or of hydrogen peroxide (H2O2). Evidence for an osmotic gating of AQPs was provided from measurements of effects of high concentration on cell Lp in Chara internodes. The osmotic dehydration is thought to be caused by the fact that the exclusion of solutes from AQPs creates tensions (negative pressures) within the water channel pores, when the osmolyte is present on both sides of the membrane. This should have affected the open/closed state by changing the free energy between states favouring a reversible distorted/collapsed state rather than the open. As expected from the C/T model, effects increased with increasing both the concentration and size of osmolytes. Pore volumes of AQPs in the plasma membrane of Chara internodes were estimated from exponential ‘dehydration curves’. The analysis of osmotic responses showed that there were narrow pores with a volume of 2.3 ± 0.2 nm3 and bigger ones with a volume of between 5.5 ± 0.8 and 6.1 ± 0.8 nm3. Alternatively, pore volumes were estimated from ratios between osmotic ( ) and diffusional (Pd) water flow as derived from measurements of hydraulic and isotopic water flows, which represent the number of water molecules (N) in a single-file pore transporting water. Values of N ranged between 35 and 60, which referred to volumes of 0.51 and 0.88 nm3/pore. This value was substantially smaller than that obtained during osmotic dehydration, but bigger than values from literature. The difference may be due to an underestimation caused by unstirred layers (USLs), which would affect Pd rather than Pf (Lp). Based on analytical solutions from diffusion kinetics and measured experimental results, even for the most rapidly permeating solute heavy water (HDO), USLs should have resulted in an underestimation of Pd by less than 30 %. Evidence for an ‘oxidative gating’ of AQPs was derived from experiments with Chara internodes, which was then tested for higher plant tissue cells as well (root cortical cells of corn). In the presence of hydroxyl radicals (*OH) as produced during the Fenton reaction (Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + *OH), cell Lp of Chara internodes was dramatically but reversibly reduced. In experiments with young corn roots, in the presence of hydrogen peroxide (H2O2), half times of water flows increased at the level of both entire roots and individual cortical cells by factors of 3 and 9, respectively, i.e., hydraulic conductivity decreased by the same factors. Results indicated that there might be a common interaction between the redox state (oxidative stress) and water relations (water stress) in plants. For solutes rapidly permeating through cell membranes, closure of water channel resulted in anomalous osmosis (negative reflection coefficients), i.e., in the striking situation that a cell did not shrink but swelled in a hypertonic medium. For the first time, anomalous osmosis has been demonstrated in roots as well, i.e., for an entire organ and in the presence of a rather complicated osmotic barrier. The phenomenon has been interpreted in terms of the composite transport structure of both the cell membrane and the root. In the presence of a rapidly permeating solute like acetone, channel closure resulted in a situation that the solute moved faster than the water, and the reflection coefficient (ss) reversed its sign.
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Das System der Verbalstämme in der arabischen linguistischen Tradition: Elemente der morphologischen und semantischen Analyse
(2006)
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Marat Yavrumyan
- Eine Besonderheit der arabisch-islamischen Kultur liegt im ausgeprägten Interesse an den eigenen sprachlichen Realien. Die Entstehung einer an den religiösen Bedürfnissen der Textexegese orientierten arabischen Sprachwissenschaft im weitesten Sinne läßt sich bis in die Anfänge des Umaiyaden-Kalifats in der zweiten Hälfte des 7. Jahrhunderts zurückverfolgen. In diesem spezifischen kultur-historischen Kontext hat sich auch das einzigartige System der sprachwissenschaftlichen Analyse formiert, die als arabische Nationalgrammatik oder als arabische linguistische Tradition (ALT) bekannt ist. Unter dem Gesichtpunkt historischer Betrachtung bedarf die Beschäftigung mit der arabischen linguistischen Tradition heutzutage keiner besonderen Begründung mehr. Dabei ist der Versuch, die einheimischen Grammatiker aus eigenen theoretischen Voraussetzungen heraus zu erklären, „in jeder Weise gerechtfertigt“. Die theoretischen und methodischen Voraussetzungen der arabischen Grammatiker würden jedoch sicher noch klarer zutage treten, wenn man diese in Relation zu neueren Systemen bringen und kritisch zu erfassen versuchen würde. Mit einer solchen Verfahrensweise ließen sich einerseits die einheimischen theoretischen und methodischen Voraussetzungen „würdigen“ und andererseits deren „Modernisierung“ - verstanden als mechanische Anwendung des Begriffsapparats der modernen Linguistik – bei ihrer Erklärung „vermeiden“. Das Vorhaben, die arabische linguistische Tradition unter Anwendung neuer Forschungsansätze adäquat zu erfassen, hat von seiner Aktualität nichts eingebüßt. Die letzten erfolgreichen Untersuchungen auf diesem Gebiet ermöglichen neue Einsichten bei der Erläuterung sowohl konkreter Problemstellungen als auch der sog. allgemeinen „Logik“ der arabischen Tradition. „The Arabs […] said what they wanted to say, but it might not be what we wanted to hear; nor did they always say it in the way we are accustomed to. Our task is not to think everything out for them but to find out what they thought and how.” (Frolov 2000:21): Im Rahmen einer solchen Herangehensweise ist es das Anliegen dieser Dissertation, einige der in der arabischen linguistischen Tradition für die morphologische und semantische Analyse verwendeten Elemente und Grundbegriffe adäquat zu erläutern. Dies geschieht vor allem anhand der grammatischen Werke von Sibawaih (gest. 180/793), az-Zamakhsari (gest. 538/1144), Ibn Yaish (gest. 643/1245) und al-Astarabadhi (gest. 688/1286). Nach Skizzierung der in der arabischen Tradition gängigen allgemeinen Vorstellungen zu Morphologie, Terminologie und den Methoden der morphologischen Analyse, werden diese am Beispiel der Nominal- und insbesondere der Verbalstämme näher ins Auge gefaßt. Die morphologische Analyse der ALT selber wird als Modellierungsprozess (tamthiyl) der Wortformen und Eingruppierung der Stämme in die Beschreibungsklassen (als Klassifizierung) dargestellt. Es folgt eine Auseinandersetzung mit den Elementen des Modellierungsprozesses, mit den morphologischen Mitteln sowie mit den funktional-strukturellen Typen der Erweiterung, die in den arabischen grammatischen Werken während der morphologischen Analyse der Stämme verwendet worden sind. Die klassifikatorischen Lösungen bei der Gruppierung der Stämme und die innersystemische Kausalität der Lösungsansätze sind separat behandelt, und zwar als eine dynamische (derivativ-kausale) Klassifikation mit einer (im Prinzip) offenen (erweiterbaren) Objektmenge bei Sibawaih und derivative Klassifikation mit einer geschlossenen (gegebenen) Menge der klassifzierten Objekte bei den späteren Grammatikern. Abschließend werden einzelne semantische Komponenten, semantische Marker, semantische Multiplikatoren und lexikalisch-semantische Klassen der Verben betrachtet, die die ALT im Rahmen der semantischen Analyse der Verbalstämme und der Verbalerweiterung ausgebildet hat. Schließlich wird der Frage nachgegangen, ob die semantischen Komponenten, die die arabischen Grammatiker in der sog. Lexik der semantischen Metasprache konsequent benutzt haben, als elementar bzw. als Indefinibilia/semantische Primitiva gedeutet werden können. Die in der Arbeit vorkommenden arabischen Begriffe und Konzepte sind in einem Glossar erfaßt und systematisch dargestellt.
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Thermodynamische Stabilisierung von Proteinen durch in vitro Evolution und biophysikalische Analyse ihrer molekularen Grundlagen
(2006)
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Michael Wunderlich
- Proteine sind zentrale Bausteine des Lebens und ihre dreidimensionale Struktur ist für die Funktion von entscheidender Bedeutung. Deswegen ist das Verständnis der konformationellen Stabilität von Proteinen von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Selektionssystem Proside zur Stabilisierung von Proteinen genutzt. Proside basiert auf der phage display Technologie und verknüpft die thermodynamische Stabilität von Proteinen mit der Infektiosität von filamentösen Phagen. Die bakteriellen Kälteschockproteine werden sowohl von experimenteller, als auch theoretischer Seite als Modellproteine zur Untersuchung der Stabilität von Proteinen genützt. Es ist bekannt, dass elektrostatische Wechselwirkungen auf der Oberfläche von sehr großer Bedeutung für ihre Stabilität sind. Deswegen sollte versucht werden, alternative Ladungsnetzwerke auf der Oberfläche des Kälteschockproteins Bs-CspB aus B. subtilis unter Verwendung von in vitro Evolution zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden Reste anhand von Sequenz- und Strukturvergleichen mit homologen Proteinen ausgewählt und diese Positionen partiell randomisiert. In einem zweiten Ansatz wurden zufällig Mutationen in das Gen von Bs-CspB eingeführt. Nach erfolgter in vitro Evolution der jeweiligen Bibliotheken konnten an sechs oberflächenexponierten Positionen stabilisierende Mutationen identifiziert werden. Die Beiträge dieser Mutationen zur thermodynamischen Stabilität von Bs-CspB wurden analysiert. Die beste Kombination war, mit einem Schmelzpunkt von 83,7°C im Vergleich zu 53,8°C vom Wildtypprotein, sogar stabiler war als das hyperthermophile Homologe Tm-Csp aus T. maritima. Einen beachtlichen Beitrag zu dieser deutlichen Stabilisierung liefern dabei verbesserte Coulomb´sche Wechselwirkungen. Die Beiträge sind dabei jedoch sehr stark von der Umgebung abhängig. Vergleiche der experimentellen Daten mit vorhandenen theoretischen Betrachtungen offenbarten die Schwierigkeiten, Coulombsche Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche korrekt zu berechnen und deren Einfluss auf die thermodynamische Proteinstabilität zu bestimmen. Ein theoretischer Ansatz, welcher unter Verwendung eines quasi-elektrischen Dipolmomentes die Einflüsse von Veränderungen der Ladungsverteilung auf die Stabilität vorhersagte, konnte experimentell nicht verifiziert werden. Ebenso konnten keine Korrelationen zwischen Veränderungen der Stabilität und der Nettoladung des Proteins festgestellt werden und auch keine Korrelation mit der Bildung von Ionenpaaren hergestellt werden. Ebenso wie Bs-CspB stellt auch die b1 Domäne des Streptokokkenproteins G ein Modellprotein zur Untersuchung von thermodynamischer Stabilität dar. In der Gruppe von S. Mayo wurde dieses Protein unter Verwendung von computational design untersucht. Dabei zeigte sich, dass die vier teilweise exponierten Reste ein sehr großes Stabilisierungspotential besitzen. Eine in vitro Evolution dieser vier Positionen durch das Selektionssystem Proside bot somit die Möglichkeit, die Leistungsfähigkeit der beiden Methoden direkt zu vergleichen. Die Selektionen lieferten eine Vielzahl von deutlich stabilisierten Proteinvarianten. Für die stabilste Variante war der Mittelpunkt des thermischen Überganges um 24,7°C erhöht. Die beste Variante aus dem computational design lag von allen untersuchten Varianten auf dem dritten Platz. Sieben der zehn berechneten Varianten, welche in den Kalkulationen alle annähernd gleich stabil waren, enthielten einzeln oder in Kombination die Aminosäurereste L18 und K29. Diese beiden Reste erwiesen sich bei der experimentellen Charakterisierung als sehr ungünstig. Um die Ursachen für diese Unterschiede zu ergründen, wurde von zwei Varianten die dreidimensionale Struktur bestimmt. Zusätzlich wurden die enthaltenen Mutationen einzeln und in unterschiedlicher Kombination thermodynamisch charakterisiert. Dabei zeigten sich bei der Analyse die Schwierigkeiten, strukturelles Verhalten in experimentelle energetische Terme zu übersetzen, was der Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse bei der Stabilisierung durch in vitro Evolution und computational design sein dürfte. Im Folgenden sollten für beide Schritte auf dem Weg zur Stabilisierung, der Auswahl von Positionen und dem Finden der besten Aminosäurereste, ein experimentelles Herangehen genützt werden. Durch Selektion von Bibliotheken mit zufälligen Mutationen, erstellt mittels fehlerhafter PCR, konnten viel versprechende Positionen identifiziert werden. Diese wurden dann einer Sättigungmutagenese mit anschließender Selektion unterworfen und die gefundenen Mutationen der beiden stabilsten Varianten wurden abschließend manuell kombiniert. Die erhaltene Variante besaß einen um 35,1°C erhöhten Übergangsmittelpunkt. Bei der Analyse der Ursachen zeigte sich, dass in diesem Fall starke hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den durch diese Mutationen eingeführten Seitenketten wirken. Dies zeigt, dass zur Stabilisierung von Proteinen vielfältige Wege beschritten werden können.
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Fused and spiro furanones from tetronic acid synthons: Oxa and azacycles featuring the butenolide ring
(2006)
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Juan-Manuel Urbina-Gonzalez
- Diverse 4-O-allyl tetronates were obtained by reaction of allyl (alpha-hydroxy)carboxylates with keteneylidenetriphenylphosphorane (Ph3PCCO) in a domino reaction (addition – Wittig olefination) and by direct allylation of tetronic acid via Fischer esterification. 3-Allyl tetronic acids were generated by Claisen rearrangement of 4-O-allyl tetronates under microwave conditions; a subsequent Conia reaction produced the corresponding spiro cyclopropane furan-2,4-diones. Nucleophilic ring opening with diverse alcohols converted the spiro cyclopropane furan-2,4-diones to 3-beta-alkyloxypropyltetronic acids. When using O-benzyl isourea for the 4-O-alkylation of 3-allyl tetronic acids, the 3-benzyl derivatives were also formed (five examples were prepared). The Mitsunobu reaction proved to be a better way for the 4-O-alkylation of 3-allyl tetronic acids. 3,3-Diallyldihydrofuran-2,4-diones with two identical allyl residues were obtained by Tsuji-Trost-type Pd-catalysed allylation of either 4-O-allyltetronates or 3-allyltetronic acids. Pd assisted allylation of sodium 3-allyltetronate with a second allyl acetate gave mixed derivatives as did the Claisen rearrangement of 4-O-allyl 3-allyltetronates under microwave conditions. 3,3-Diallyldihydrofuran-2,4-diones were converted to butanolides with 3,3-spirocyclopentenyl or 3,4-cycloalkanyl annulation by ring closing methathesis with Grubbs’ catalysts. Natural product pesthetoxin was prepared via a double Ph3PCCO addition to alpha-hydroxy benzyl octanoate, thus demonstrating the utility of keteneylidenetriphenylphosphorane as a C2O building block. Finally, (-)-3-epi-blastmycinolactol was prepared enantioselectively via double hydrogenation of 3-but-2-enyl tetronic acid.
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Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus der RNA-Helikase YxiN - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer in einzelnen Molekülen
(2006)
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Bettina Theißen
- Die Aufhebung von RNA-Sekundärstrukturen und RNA-Protein-Wechselwirkungen durch RNA-Helikasen ist für viele zelluläre Prozesse von grundlegender Bedeutung. Die RNA-Helikase YxiN aus Bacillus subtilis ist an der Biogenese der Ribosomen beteiligt. YxiN besitzt neben den beiden konservierten Helikasedomänen eine dritte, RNA-bindenden Domäne, die für die Sequenzspezifität verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurden Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus von YxiN mittels Einzelmolekül-FRET-Experimenten untersucht, um Einblick in den Mechanismus der RNA-Entwindung zu erhalten. Rekombinantes YxiN konnte in nativer Form aus Escherichia coli gereinigt werden. YxiN bindet Adeninnukleotide und zeigt eine feste Bindung von RNA. In gekoppelten spektroskopischen Tests wurde die RNA-abhängige ATP-Hydrolyse beobachtet. Die ATP-abhängige RNA-Entwindung wurde in einem dafür entwickelten fluoreszenzbasierten Test in Polyacrylamidgelen nachgewiesen. Für Einzelmolekül-FRET-Experimente wurde YxiN mit zwei Fluorophoren markiert. Dazu mussten zunächst die zugänglichen Cysteine des Wildtyps durch Serin ersetzt werden. Anschließend wurden Cysteine an potentiell lösungsmittelzugänglichen Positionen eingeführt und durch Reaktion mit Dithionitrobenzoat (DTNB) und Tetramethylrhodamin-Maleimid auf ihre Zugänglichkeit getestet. Die Reaktivität der Cysteine mit farbstoffgekoppeltem Maleimid unterschied sich dabei deutlich von der Reaktivität mit DTNB. Die YxiN-Mutanten mit zugänglichen Cysteinen zeigten ähnliche Stabilität und Aktivität wie der Wildtyp. YxiN-Mutanten mit je einem zugänglichen Cystein in beiden Helikasedomänen wurden mit Alexa488 als Fluoreszenzdonor und Tetramethylrhodamin als Akzeptor markiert. Mit limitierter Proteolyse und anschließender Detektion der Fluoreszenz der Fragmente in Polyacrylamidgelen konnte die Orientierung der Fluorophore in YxiN überprüft werden. In Ensemble-Fluoreszenzspektren von doppelt markiertem YxiN konnten keine Änderungen der FRET-Effizienz bei der Substratbindung detektiert werden. In Einzelmolekül-FRET-Experimenten hingegen konnten zwei verschiedene Zustände mit unterschiedlicher FRET-Effizienz identifiziert werden, die zwei verschiedenen Konformationen entsprechen. Die offene Konformation des freien YxiN bleibt auch in Gegenwart von Nukleotiden erhalten. Die zweite, geschlossene Konformation tritt erst in Gegenwart von RNA auf und wird bei der Bindung von ATP stärker populiert. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird für den Mechanismus der RNA-Entwindung durch YxiN ein erweitertes Destabilisierungsmodell vorgeschlagen. Die C-terminale RNA-Bindungsdomäne positioniert dabei die Helikase sequenzspezifisch auf der RNA. Die beiden Helikasedomänen binden unspezifisch an einzelsträngige RNA oder den Übergang von Einzelstrang zu Doppelstrang in der Umgebung. Dabei schließt sich der Spalt zwischen den Domänen. Die Hydrolyse von ATP oder die anschließende Freisetzung von ADP führt zu der Destabilisierung einiger Basenpaare des RNA-Doppelstranges, so dass ein kurzer RNA-Doppelstrang dissoziieren kann. Einzelmolekül-FRET-Experimente eignen sich also zur Beobachtung von Konformationsänderungen in YxiN und liefern damit Einblick in den Mechanismus der RNA-Helikase. Weiterführende Experimente werden ein detailliertes Verständnis für den Mechanismus der RNA-Entwindung durch YxiN ermöglichen.
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Simulation, Optimale Steuerung und Sensitivitätsanalyse einer Schmelzkarbonat-Brennstoffzelle mithilfe eines partiellen differential-algebraischen dynamischen Gleichungssystems
(2006)
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Kati Sternberg
- Brennstoffzellen besitzen wegen ihrer Effizienz und den niedrigen Schadstoffemissionen ein hohes Zukunftspotential. Ein breiter Einsatz von Brennstoffzellen ist derzeit jedoch noch nicht möglich, sodass ein erheblicher Forschungs- und Entwicklungsbedarf besteht, der die Bereiche der Werkstoffentwicklung, der Brennstoffspeicherung, der Prozessanalyse sowie der Prozesssteuerung umfasst. Bei der Analyse und der Steuerung der chemisch-physikalischen Abläufe innerhalb der Zelle müssen insbesondere bei Hochtemperaturzellen wie der Schmelzkarbonat-Brennstoffzelle (englisch: molten carbonate fuel cell, MCFC) die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Komponenten der Brennstoffzelle bei hohen Temperaturen verstanden und vorhergesagt werden. Dazu ist eine formale Beschreibung für die zeitliche Entwicklung der Gasströme, der Temperatur und der elektrischen Spannung in Abhängigkeit der intern stattfindenden elektro-chemischen Reaktionen auf dem örtlich verteilten Gebiet der Brennstoffzelle notwendig. Die Schmelzkarbonat-Brennstoffzelle kann durch ein komplexes, semilineares System partieller differential-algebraischer Gleichungen modelliertwerden, das sich aus partiellen Reaktions-Diffusionsgleichungen parabolischen Typs, Reaktions-Transportgleichungen hyperbolischen Typs, gewöhnlichen Differentialgleichungen und algebraischen Gleichungen zusammensetzt, wobei die Randbedingungen durch ein zusätzliches, nichtlineares gewöhnliches Integro-Differentialgleichungssystem gegeben sind. Inwieweit eine analytische oder numerische Lösung dieses Gleichungssystems generiert und damit das statische und dynamische Verhalten der Brennstoffzelle am Modell untersucht werden kann, hängt von der Art der Differentialgleichungen und ihren besonderen Eigenschaften ab. Neben dieser Prozessanalyse sollen jedoch auch die in der Brennstoffzelle ablaufenden Prozesse gesteuert, speziell optimal gesteuert, werden. Dazu wird ausgehend vom Differentialgleichungssystem ein Optimalsteuerungsproblem aufgestellt, dessen analytische und numerische Lösbarkeit eng mit der Lösbarkeit des Differentialgleichungssystems verknüpft ist. Zusätzlich wird die Lösung dieses Optimalsteuerungsproblems durch Ungenauigkeiten in der zugrundeliegenden Datenbasis erschwert, die keine exakten und allgemeingültigen Werte für die Modellparameter liefert. Es muss daher neben der Suche nach einer optimalen Lösung auch betrachtet werden, inwieweit schon geringe Störungen der Modellparameter die Lösung ändern. Ziel dieser Arbeit ist das maßgebliche dynamische Verhalten von Schmelzkarbonat-Brennstoffzellen hinsichtlich Fragen zur Prozessführung zu analysieren und auf Basis dieser Ergebnisse Konzepte zur optimierten Prozessführung zu entwickeln. Zu diesem Zweck beschäftigt sich diese Arbeit mit der Simulation, der optimalen Steuerung und der Sensitivitätsanalyse des mathematischen Modells einer Schmelzkarbonat-Brennstoffzelle. Basierend auf einer Untersuchung zur Existenz von Lösungen für Teilmodelle bzw. einzelne Gleichungen wird die numerische Lösung des Differentialgleichungsmodells präsentiert. Als Steuerungsszenario wird ein Lastwechsel, d.h. ein plötzlich auftretender Wechsel der Stromstärke, betrachtet. Das Ziel ist, nach dem Lastwechsel mithilfe einer optimalen Randsteuerung möglichst schnell in den neuen stationären Zustand zu gelangen und damit die Effizienz der Zelle zu steigern. Ein zweites Anliegen ist, eine möglichst gleichmäßige Temperaturverteilung zu erreichen, um Materialspannungen zu vermeiden und damit die Lebensdauer der Zelle zu erhöhen. Dabei muss jedoch auch die Abhängigkeit der Ergebnisse der Optimalen Steuerung von Störungen in den Modellparametern mittels einer Sensitivitätsanalyse untersucht werden.
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New Carbazole Based Materials for Optoelectronic Applications
(2006)
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Martin Sonntag
- The motivation for this thesis was the synthesis, characterization and the testing of new, environmentally stable materials based on aromatic amines for OFET and OLED applications. The preparation of high quality thin films from solution as well as from the gas phase was an another important issue. The first part of this thesis deals with star-shaped molecular glasses with triphenylamine as core molecule. Substituted fluorene and carbazole units were attached to the core molecule as side arms via a trifold Suzuki cross coupling reaction. The target compounds were highly purified by medium pressure liquid chromatography (MPLC) as purity is an important prerequisite for organic materials to be used for optoelectronic applications. Before the new materials were finally tested in transistor devices, a suitable surface treatment of the OFET substrates was developed. By introducing self-assembled monolayers, prepared from hexamethyldisilazane (HMDS), on top of the SiO2 insulator layer of the FET substrates, the field-effect mobility was increased by at least one order of magnitude. Furthermore it was possible to improve on/off-ratios as well as turn on voltages. In conclusion hole carrier mobilities up to 3 x10-4 cm2/Vs and on/off-ratios of 10000 were achieved from the new star-shaped compounds. The performance of the devices was not affected by a four month storage period in air and daylight. The second part of this thesis describes the synthesis and characterization of a new class of fused heterocycles based on carbazole units. For this issue a series of bisindenocarbazoles is introduced as a new class of fused heterocycles. A synthetical procedure was designed which allows to tailor the thermal properties of the target compounds by introducing different alkyl substituents in the very last step of the synthesis. Yields up to 50 % can be obtained after six synthetical steps including purification of the intermediates. CV measurements showed the electrochemical stability of the novel compounds. Altogether five bisindenocarbazoles with different alkyl substitution patterns have been prepared and characterized. Their morphology varies from highly crystalline materials with short alkyl side chains to amorphous molecular glasses if longer or branched alkyl groups are attached to the core. As the bisindenocarbazoles exhibit a bright blue fluorescence together with high quantum yields, they were tested as blue emitter for OLED applications. In typical setups for blue light emitting LEDs, the blue emitter is doped into a wide band gap host material in order to avoid quenching of the electroluminescence and to adjust the energy levels of the different materials used in the setup. For this issue CBP, mCP and TCTA were tested as matrix materials together with a bisindenocarbazole as emitter. A combinatorial evaporation setup was used for the preparation of the OLED devices in order to dope the different host systems by co-evaporation of the bisindenocarbazole dye. This deposition method also allows the variation of the film thicknesses of the charge transport layers in a single experiment. By using this device architecture a deep-blue emission from the bisindenocarbazole dye at CIE color coordinates of x = 0.19 and y = 0.17 was obtained at a hole blocking layer thickness of 40 nm. Luminance values up to 200 cd/m2 were achieved with this series of devices. The turn on of the light emission was observed at 5 V. These very first results show that the bisindenocarbazole is a promising new blue fluorescent emitter for organic LEDs. Due to the rigid rod-like core of the bisindenocarbazole it was possible to obtain a novel derivative exhibiting a broad nematic mesophase by extending the core with aromatic side groups. By using a suitable alignment method, it is possible to obtain well ordered LC monodomains from which increased charge carrier mobilities can be obtained. The nematic LC phase was characterized with polarizing microscopy (POM) and small angle X-ray scattering (SAXS).
