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Analyse der Funktion und Regulation des ECF-Sigmafaktors YlaC aus Bacillus subtilis
(2005)
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Stephan Zellmeier
- Alternative Sigmafaktoren mit extracytoplasmatischer Funktion (ECF-Sigmafaktoren) repräsentieren eine sich kontinuierlich vergrößernde Gruppe an Regulatorproteinen, die an der differentiellen Genexpression in Bakterien beteiligt sind. Obwohl Gene, welche durch diese Regulatorproteine kontrolliert werden, ebenso wie die Regulationsmechanismen noch weitgehend unaufgeklärt sind, scheinen ECF-Sigmafaktoren in Bakterien eine Schlüsselrolle im Bereich der Stressantwort, der Differenzierung und der Pathogenese zu spielen. In dem Gram-positiven Modellorganismus B. subtilis konnten bislang sieben Gene mit Ähnlichkeiten zu ECF-Sigmafaktoren identifiziert werden (sigX, sigW, sigM, sigY, sigV, sigZ und ylaC), wobei hauptsächlich sigX, sigW und sigM im Zentrum durchgeführter Untersuchungen standen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der potentielle ECF-Sigmafaktor YlaC hinsichtlich seiner Funktion und Regulation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ylaC Teil eines tetracistronischen Operons ist und mit dem Gen seines möglichen Anti-Sigmafaktors kotranskribiert wird. Zusätzlich kodiert das Operon für zwei weitere Membranproteine mit bislang unbekannter Funktion. Obgleich kein spezifischer Stressfaktor identifiziert werden konnte, wurde die positive Regulation des ylaA-Operons durch YlaC eindeutig gezeigt. Die Ergebnisse einer globalen Transkriptionsanalyse deuten darauf hin, dass YlaC ausschließlich sein eigenes Operon reguliert. Durch Primer-Extension konnte der Transkriptionsstartpunkt des ylaA-Operons bestimmt werden. Die ermittelte Promotorsequenz ähnelt bereits identifizierten Promotorsequenzen von ECF-Sigmafaktoren aus B. subtilis. Die für den ylaA-Promotor ermittelte Sequenz konnte vor keinem anderen Ges des B. subtilis-Genoms gefunden werden. Durch Northern-Blots und b-Galaktosidase-Tests mit einem DylaD-Stamm wurde gezeigt, dass YlaD als Anti-Sigmafaktor von YlaC wirkt. Gereinigtes YlaD bindet Zink in äquimolaren Mengen und wird deshalb einer neu-definierten Familie von Zink-bindenden Anti-Sigmafaktoren zugeordnet. YlaD ist ein Membranprotein, dessen C-terminus in der Cytoplasmamembran verankert ist. Nach Überexpression konnte YlaD in Western-Blots nur dann nachgewiesen werden, wenn das yluC-Gen, welches für eine intramembrane Protease kodiert, deletiert war. Eine YluC-Variante mit einer Mutation im aktiven Zentrum war nicht mehr in der Lage, das sW-Regulon aus B. subtilis zu aktivieren. In einer DyluC-Mutante reicherten sich auch verkürzte Formen der SigX und SigM Anti-Sigmafaktoren an, was auf eine generelle Rolle von YluC bzw. von intramembraner Proteolyse bei der Regulation von ECF-Sigmafaktoren in B. subtilis hindeutet. Eine mögliche Funktion der bislang uncharakterisierten Membranproteine YlaA und YlaB bei der Regulation der YlaC-Aktivität wurde durch die Konstruktion von Reporterstämmen, welche verschiedene Kombinationen aller vier Gene des ylaA-Operons enthielten, analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von YlaB einen Einfluss auf die Anti-Sigmafaktor-Aktivität von YlaD hat. Durch Western-Blots war ein stabilisierender Einfluss von YlaB auf YlaD nachweisbar. Eine direkte Interaktion zwischen YlaB und YlaD konnte durch in vitro-Experimente gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YlaD, zusammen mit YlaB und eventuell auch mit YlaA, Teil eines membrangebundenen Proteinkomplexes ist, der YlaD vor dem Abbau durch YluC schützt.
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The Aggregation Behavior of Mixture of Alkylmethylaminoxides with Their Protonated Analogues in Aqueous Solution
(2005)
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Yuji Yamashita
- The C12C8MAO aqueous solution at 100 mM consisted of two phases which were optically isotropic and low viscous. Addition of chloric acid induced a phase transition, and the following lamellar (L-alpha) phase was formed in the range of low protonation degree, X = 0.007 – 0.35. When the surfactant was protonated further (X > 0.35), the single L-alpha phase separated again into two isotropic phases. The abnormal phase sequence could be interpreted by the result that mixtures of protonated and non-protonated C12C8MAO were more surface active than each component. The surface and interfacial measurements showed synergism of mixing two components. This synergistic effect arised from the peculiar interaction of hydrogen bonding between protonated and non-protonated head groups. This short-range interaction would cause the C12C8MAO molecules to be more lipophilic with protonation, resulting in the phase separation at high protonation degree. The SAXS measurements in the L-alpha phase also showed the synergistic effect between the head groups. The rheological measurements and microscope observations demonstrated that the morphologies of L-alpha phase could be controlled by preparation routes. It was found that the vesicles were transformed into the classical lamellar phase by the simple process of heating and cooling through the phase transition (L-alpha <-> L-alpha;/L1) temperature. Furthermore, the classical, planar lamellar morphology could be prepared by means of kinetic protonation of the C12C8MAO molecules using hydrolysis reaction. Any classical L phase was modified to the vesicle form under shearing, and its transformation was irreversible in terms of shear force. Various acids were treated as protonation agent in 100mM C14DMAO aqueous solution, and their contributions to the viscosity of solution were examined ranging X = 0 to 1. It was elucidated that the aggregate structure remarkably depended on the ion-pair (counte-ion) thermodynamics. For the Cl-, HCOO-, and H2PO4- ions, no remarkable structural change took place with increasing protonation. For the Br-, NO3-, Oxalate, Tartarate, Tartronate, and SO42- ions, the small micelles of C14DMAO grew up with protonation. For the ClO4-, SCN-, and Salicylate ions, the L-alpha phase was formed with protonation. The interfacial curvature thus followed mostly the sequence of Hofmeister series, while the sulfuric ion was completely excluded from the series because of its divalency. The viscosity change was interpreted quantitatively by the hydration free energy (Delta-Ghyd) of counter-ion. However the divalent counter-ions did not arrange in the same order as the monovalent ones, that could be considered to arise from (1) depressing pKa of C14DMAO with increasing amount of acid and (2) electrostatic force within the diffuse double layer. For different counter-ions, the characteristic scaling laws of viscosity evolution against X were observed. The scaling laws also obeyed Delta-Ghyd. Sulfate, however, could not be manipulated by Delta-Ghyd: regardless of its strong hydrophilicity (high Delta-Ghyd), the excess amount of SO42- caused the micelles to grow up. The micelle growth therefore would be attributed by counter-ion condensation onto the micelles rather than hydrophilicity itself. Comprehensively it was proved that Delta-Ghyd and the ionic valency (electrostatic force) of counter-ion played strikingly significant roles in the structural properties. Trifluoro acetic acid CF3COOH behaved as hydrophobic acid, however, the viscosity trend could stand in neither the sequence of Delta-Ghyd nor the Hofmeister series. The interfacial tension measurments suggested that the CF3COO- ion was incorporated into the micelle, behaving like co-surfactant. Synergism on mixing was also observed in the CF3COOH system, by which the minimal CMC was obtained. The interaction parameter beta indicated that CF3COOH caused the stronger synergistic effect than HNO3. However, some experiments showed the successively hydrophobic C14DMAO with protonation. This would be due to the orientation of hydrophobic trifluoro group in the palisade layer of micelle. The increasing volume fraction of hydrophobic moiety in the surfactant molecule (OleylDMAO) built up the bilayer structure even using the strongly hydrated acids. The L-alpha formation was referred to synergism because the isotropic micellar phase was present on both the sides of high and low protonation degrees. The L-alpha phase melted on elevating temperature, and the subsequent L1 phase was highly viscoelastic. The L-alpha - L1 transition temperatures for different acids were almost correlated by the enthalpy of hydration (DeltaHhyd). And the viscoelastic properties of the L-alpha phases were dependent on the Hofmeister series.
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Pollination Biology of Gentianales in a Southern Ecuadorian Montane Forest
(2005)
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Doris Anne Wolff
- The pollination and reproductive biology of mostly small flowered, taxonomically related species of the monophyletic order Gentianales (Apocynaceae including Asclepiadoideae, Gentianaceae, and Rubiaceae) was investigated in a tropical montane forest in southern Ecuador. This study is part of an interdisciplinary project on the diversity and functioning of a montane ecosystem, and provides important results with respect to pollination biology. Such data are rarely collected for such a large number of taxa in a way that permits asking questions concerning both community ecology and evolution. This thesis investigates the contribution of diurnal floral visitors to the reproductive success of the night flowering "sphingophilous" Isertia laevis (Rubiaceae), and discusses the value of pollination syndromes in characterizing the pollinator spectrum of a given plant. Isertia laevis possesses flowers that are morphologically adapted to pollination by sphingids, but diurnal flower observation showed that nine different hummingbirds (Trochilidae) were frequent visitors. At night, only a few sphingid individuals were observed. Pollination experiments showed that flowers exclusively presented to nocturnal pollinators had a low fruit set (14%) but a high seed set (59%). Flowers accessible only to diurnal floral visitors showed a high fruit set of 63%, but a low seed set of 14%. Efficiency of pollination (fruit set X seed set) was equal for both diurnal and nocturnal pollinators. This shows that frequently occurring, but not very effective pollinators contribute substantially to seed production when the expected pollinators are scarce. This study is one of the first examining the pollination biology of Apocynaceae-Asclepiadoideae, tribe Asclepiadeae (other than the temperate genus Asclepias), providing basic information on a plant's reproductive biology, focusing on animal-plant interactions of these mostly twining, highly scattered inhabitants of forests and forest margins, possessing very small, inconspicuous flowers. A large variety of floral visitors was observed on the flowers, however, pollinaria were carried by only four insect species. The flowers showed a comparatively low pollinaria removal rate with an average of 0.32 ± 0.13, and an even lower average was recorded for the pollinia insertion rate at 0.13 ± 0.07. The percentage of inserted pollinia to removed pollinaria was comparatively high with an average of 42.7% ± 22.3%. This shows that if an insect achieves pollinia transfer, it does so very effectively. The derived floral structure and pollinating system in the Apocynaceae-Asclepiadoideae has often been characterized as a very close flower-pollinator interaction. The present study, however, suggests limited specialization, with some degree of generalization. Sucrose is the predominant floral nectar sugar in the order Gentianales (although the order possesses flowers morphologically adapted to ornithophily, sphingophily, chiropterophily, melittophily, and myiophily), suggesting that nectar sugar composition is a conservative characteristic. The only significant differences in sugar composition were found in chiropterophilous and myiophilous flowers, which had a significantly lower sugar ratio than sphingophilous flowers. A separation of chiropterophilous and myiophilous flowers from the other pollination syndromes was further substantiated by non-metric, multidimensional scaling using the CNESS index of dissimilarity, based on nectar sugar compositions. Further, matrix tests revealed no correlation of observed floral visitors to nectar concentrations, whereas a weak significant correlation was found between floral visitors and nectar sugar compositions. Therefore, some degree of adaptive convergence of floral nectar compositions to principal pollinator type within the constraints set by phylogenetic history is likely. Matrix tests revealed a correlation between floral visitors and nectar volume of covered flowers, and to a lesser extent, of uncovered flowers. The nectar volumes of covered and uncovered flowers were related to, and differ significantly among, pollination syndromes. Therefore, the driving force to visitation appears to be the volume of nectar the visitor can expect to consume. A phylogenetic study of Arcytophyllum (Rubiaceae) based on Internal Transcribed Spacer (ITS) was conducted and compared with an earlier study based on cpDNA. To understand the expression of heterostyly in the genus, we analyzed the inter- and intraspecific variation in floral morphology, nectar, pollen-ovule ratio, and seed set of ten species in eleven populations. Stigma and anther levels differed significantly between the morphs in the species/populations investigated except in A. filiforme. Different expressions of heterostyly in Arcytophyllum seemed independent of phylogenetic relationships, however, there was a tendency towards a higher percentage of sucrose in the more derived species of the genus. Nectar sugar composition was similar between the morphs. Pollen dimorphism, both with regard to number (long-styled > short-styled) and to size (short-styled > long-styled) was observed in all taxa investigated except for A. filiforme. This shows that both features in the expression of heterostyly and the reproductive system may vary among closely related species.
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Montmorillonit K10 als Trägermaterial in der metallocenkatalysierten Olefinpolymerisation; Strukturanalyse des Schichtsilicats und Katalysatorsystems, Charakterisierung der Nanocomposite
(2005)
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Christine Wirth
- Heterogene Katalysatorsysteme mit Triisobutylaluminium-modifiziertem Montmorillonit K10 und Zirconocen- und Titanocenkomplexen wurden im Arbeitskreis Weiss äußerst effizient in der Ethylen- und Propylenpolymerisation eingesetzt. Mit der Zielsetzung Zusammenhänge zwischen Struktur und Trägeraktivität des säureaktivierten Schichtsilicats aufzuzeigen wurde eine Strukturcharakterisierung mittels der analytischen Methoden TG/DTA-MS, REM, TEM, Pulverdiffraktometrie, N2-Physisorption, FTIR und 29Si-, 27Al-, 1H- MAS-NMR-Spektroskopie durchgeführt. Anhand des Vergleichs mit dem unbehandelten Rohmaterial Montmorillonit wird dargelegt, dass durch die Säureaktivierung Kristallite entstehen, welche in der Mitte eine noch intakte Dreischichtstruktur, an den Rändern durch die Auflösung der Oktaederschicht amorphe kieselsäureähnliche Bereiche aufweisen. Dadurch resultieren im K10 Veränderungen physikalischer Eigenschaften wie eine Erhöhung um das 1,3-fache der spezifischen Oberfläche (200m2/g) sowie des Porenvolumens (0,33ml/g). Durch die Säurebehandlung wird eine deutlich breitere Porengrößenverteilung erhalten, wobei sowohl größere Keilporen durch osmotische Quellung der protonierten Zwischenschicht als auch kleinere Meso- bis Mikroporen innerhalb der ungeordneten Tetraederschicht-Randbereiche entstehen. Mit den gebildeten hydratisierten Silicatbereichen sowie dem H+-Austausch im Zwischenschichtraum ergeben sich neue chemische Umgebungen, welche im K10 als dreidimensionales Silicatnetzwerk (Q4, 29Si-MAS-NMR), als Defekt-Silanolgruppen (FTIR; 29Si, 1H) sowie in Form einer erhöhten Acidität (saure H+, 1H) detektiert werden. Die Untersuchungen am TIBA-modifizierten K10 (ICP-AES, TG/DTA-MS, Pulverdiffraktometrie, N2-Physisorption, FTIR, 29Si-, 27Al-, 1H- MAS-NMR) weisen einerseits Aluminium und Alkylgruppen nach und zeigen andererseits die aufgefächerten Silicatschicht-Randzonen als Reaktionsort an. Das Verschwinden der für isolierte SiOH-Gruppen charakteristischen IR-Bande im TIBA-behandelten K10 sowie ein zusätzliches, dem struktureigenen oktaedrischen und tetraedrischen Aluminium gleichgestelltes Aluminiumsignal belegen die chemische Anbindung des Aluminiumalkyls an die Oberfläche des Schichtsilicats. Eine Oligomer- bzw. Kettenbildung ist nicht auszuschließen. Das heterogene Katalysatorsystem aus K10/TIBA und den Metallocenen Cp2ZrCl2 oder rac-EtInd2ZrCl2 generiert das aktive Metallocenkation, welches sowohl Ethylen- als auch Propylen mit guten Aktivitäten polymerisiert. Das Trägermaterial K10 wurde unterschiedlicher thermischer Vorbehandlung sowie Kationenaustauschreaktionen unterzogen und anschließend in der Ethylenpolymerisation getestet. Dabei stellt sich eine Abhängigkeit der Polymerisationsaktivität vom Hydrationszustand des Trägermaterials sowie von der chemischen Beschaffenheit des Zwischenschichtraumes heraus. Ungetrockneter Montmorillonit K10 weist die höchste Aktivität auf, durch Trocknung kollabierte Schichten im K10 bedingen eine Abnahme der Aktivität, Calcinierung bei hohen Temperaturen führt zu drastischem Aktivitätsverlust. Nach Kationenaustauschreaktion mit Ba2+-Ionen bleibt die Trägeraktivität des K10 erhalten. Der Austausch der Zwischenschichtkationen mit Cs+-Kationen führt zur Verdrängung des Zwischenschichtwassers und infolgedessen zu kollabierten Schichten. Mit Alkylammoniumionen ((CH3)4N+, (CH3)3N+C16H33) organophilierter Montmorillonit K10 (Org+-K10) weist neben der Einlagerung in die Zwischenschicht Oberflächenbelegung durch die organischen Moleküle auf. Sowohl Cs+- als auch Org+-K10 sind als Trägermaterial inaktiv in der Ethylenpolymerisation. Bei den in situ katalysierten Polymeren handelt es sich um Nanocomposite (NCs) mit 3-11% Schichtsilicatanteil. Die für Nanocomposite wesentlichen Strukturmerkmale und Eigenschaften (Verteilung des Füllstoffs im Polymer, mechanische Eigenschaften) wurden mittels Pulverdiffraktometrie, TEM und Zugprüfungsmessungen untersucht. Es kann eine sehr gute Anbindung der Polyethylen- sowie Polypropylenmatrix an den ungeordnet interkalierten bis partiell exfolierten Montmorillonit nachgewiesen werden. Diese starke Füllstoff-Polymer-Wechselwirkung führt zu herausragend guten mechanischen Eigenschaften im Rahmen der Zugprüfung. Die K10-PE-Nanocomposite zeigen im Vergleich zum homogen katalysierten PE ohne Schichtsilicatanteil eine immer noch hohe Reißdehnung und eine drastische Erhöhung der Reißfestigkeit. Dabei wird der höchste Wert (45MPa), welcher Literaturwerte sowohl vergleichbarer schmelzinterkalierter NCs als auch in situ hergestellter PE-NCs übersteigt, bei Einsatz von gesichtetem Montmorillonit K10 mit enger Partikelgrößenverteilung erzielt. Die gute Adhäsion an das Polymer belegt die starke chemische Bindung des Metallocens an die Oberfläche des TIBA-modifizierten Montmorillonits im eingesetzten heterogenen Katalysatorsystems.
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Dynamischer Zusammenbruch der schwachen Lokalisierung von Photonen
(2005)
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Christian Wickles
- Der Gegenstand dieser Arbeit ist die genauere Untersuchung des Phänomens des dynamischen Zusammenbruchs der schwachen Lokalisierung von Photonen und die zugrundeliegenden physikalischen Mechanismen. Die Betonung liegt dabei auf dem Einfluss der externen Freiheitsgrade bzw. der Schwerpunktsbewegung, so dass Atome mit einfachst möglicher interner Struktur angenommen werden.
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Eine $L^q$-Theorie des Cosseratspektrums in beschränkten Gebieten und Außengebieten
(2005)
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Stephan Weyers
- In der vorliegenden Arbeit wird die Frage untersucht, für welche (Eigenwerte) a in R nichttriviale klassische oder schwache $L^q$-Lösungen (Eigenfunktionen) des Cosseratspektrums existieren $$ \Delta \U u = a \nabla \Div \U u, \qquad \U u \Big|_{\partial G}=0 $$ wobei G ein beschränktes Gebiet oder ein Außengebiet ist. Dieses Problem wurde erstmals von den Brüdern Eugène und Francois Cosserat untersucht. Es ist ein Spezialfall der Lamé-Gleichung und beschreibt die Auslenkung eines linearen, isotropen, homogenen elastischen Mediums ohne Einwirkung einer äußeren Kraft im statischen Fall. In dieser Arbeit wird das schwache Cosseratspektrum für beschränkte Gebiete und Außengebiete und 1<q bestimmt. Es ist a = 1 Eigenwert unendlicher Vielfachheit und a = 2 Häufungspunkt von Eigenwerten endlicher Vielfachheit. Die Gebrüder Cosserat (1900) bestimmten das klassische Cosseratspektrum für spezielle Gebiete wie Kugel, Annulus und Ellipsoid. Allgemeine Resultate stammen von Mikhlin (1973), der das Cosseratspektrum im Fall n=3 und q=2 bestimmte, und Kozhevnikov (1993), der beschränkte Gebiete im Fall n=3 und q=2 behandelte. Kozhevnikovs Beweis beruht auf der Theorie der Pseudodifferentialoperatoren. Faierman, Fries, Mennicken und Möller (2000) führten einen direkten Beweis für beschränkte Gebiete, n>=2 und q=2. Michel Crouzeix gelang 1997 ein sehr einfacher Beweis für beschränkte Gebiete, n=2,3 und q=2. In dieser Arbeit wird die Beweisidee von Crouzeix aufgegriffen, und die obigen Resultate werden für beschränkte Gebiete und Außengebiete, n>=2 und 1<q gezeigt. Ein weiteres Resultat ist, dass die Eigenräume zu Eigenwerten a in R\{1,2} nicht von q abhängen. Für diese Eigenfunktionen existieren höhere (klassische) Ableitungen. Deshalb ist auch für das klassische Cosseratspektrum a =2 Häufungspunkt von Eigenwerten. a =1 ist auch klassisch immer ein Eigenwert. Aus der Lösung des Cosseratspektrums folgt als Anwendung ein Zusammenhang zwischen der Greenschen Funktion zum Laplace-Operator und dem reproduzierenden Kern in Bergman-Räumen.
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Lq-solutions to the Cosserat spectrum in bounded and exterior domains
(2005)
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Stephan Weyers
- In the present paper we consider the existence of non-trivial classical and weak Lq-solutions of the Cosserat spectrum $$ Delta U u = a abla Div U u, qquad U u Big|_{partial G}=0 $$ where G is a bounded or an exterior domain with sufficiently smooth boundary. This problem firstly was investigated by Eugene and Francois Cosserat. It is a special case of the Lame equation and describes the displacement of a homogeneous isotropic linear static elastic body without exterior forces. We can prove that a = 1 is an eigenvalue of infinite multiplicity and a = 2 is an accumulation point of eigenvalues of finite multiplicity. E. and F. Cosserat (1900) studied the classical Cosserat spectrum for certain types of domains like a ball, a spherical shell or an ellipsoid. General results are due to Mikhlin (1973), who investigated the Cosserat spectrum for n=3 and q=2, and Kozhevnikov (1993), who treated bounded domains in the case n=3 and q=2. Kozhevnikovs proof is based on the theory of pseudodifferential operators. Faierman, Fries, Mennicken and Möller (2000) gave a direct proof for bounded domains, n>=2 and q=2. Michel Crouzeix 1997 gave a simple proof for bounded domains, n=2,3 and q=2. In this paper we use the idea of Crouzeix to prove the results for bounded and exterior domains, n>=2 and 1<q. For the Lq-solutions of eigenvalues a in R {1,2} we can prove the existence of higher (classical) derivatives. Furthermore they do not depend on q. a =2 is an accumulation point of eigenvalues of the classical Cosserat spectrum, too, and a =1 is also a classical eigenvalue. As an approach we searched for a relationship of Greens function of the Laplacian to the reproducing kernel in Bergman spaces. We couldnt prove that directly. But after solving the Cosserat spectrum in another way we can prove the relationship indirectly.
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Development of broadly applicable transgenic tools for the transposon mutagenesis of the red flour beetle, Tribolium castaneum
(2005)
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Ivana Viktorinová
- The discovery of non-species-specific, broad-range transposable elements and the establishment of a universal 3xP3 promoter revolutionized insect transgenesis. It overcame the limitations of the germ-line transformation to be restricted to the model organism Drosophila melanogaster. In combination with discernable fluorescent markers, multi-component systems, such as transposon-based insertional mutagenesis, can now be introduced to various insect species. To drive the transposase gene for transposable element remobilisation, suitable promoters are needed. The broadly conserved thermotolerance factor, Hsp70, is well-characterised in D. melanogaster and its promoter, which is inducible by high temperatures, provides a genetic tool for transient gene activation. In this thesis, I could prove that the D. melanogaster hsp70 promoter is functional in Tribolium castaneum as well. Its observed basal level activity, however, must be considered and limits its use for experiments, where no strict transient gene expression is required. Nevertheless, the D. melanogaster hsp70 promoter will suffice to provide an efficient transposase source in transposon-based mutagenesis screens in T. castaneum. The remobilization of non-autonomous transposable elements in such screens results in novel mutations and tagging of potentially interesting cis-regulatory elements. To further investigate gene functions, misexpression studies are necessary. In D. melanogaster, this can be done by directed binary expression systems. Here I could show, that the combination of Gal4delta/UAST works best in D. melanogaster somatic tissue, whereas the LexA/(LL)4 and the tetracycline-controlled systems seem to function only poorly. All constructs are based on broad range transposons as well as universal markers and promoters, so that they can be used in other insect species to determine the best system. Preliminary tests in T. castaneum, however, showed that there are a number of additional problems that need to be addressed, before a suitable binary expression system can be established for this species. The full genome sequence of T. castaneum is now available. Therefore, interesting mutations, cis-regulatory elements and their biological functions can be directly linked to the sequence level. When target sites of site-specific recombination systems are included in insertional mutagenesis screens, their insertion sites can be precisely identified and designed chromosomal rearrangements (inversions, duplications and deletions) created. Here I could present a universal system, which can be introduced into non-drosophilid species and enables such chromosomal rearrangements, which I could successfully demonstrate in D. melanogaster. Defined inversions suppressed meiotic recombination between inverted and non-inverted regions on homologous chromosomes and can thus serve as defined balancer chromosomes. Also defined deletions/duplications were generated in D. melanogaster. Such aberrations will be crucial in other insect species, like T. castaneum, to safely keep mutation stocks and identify gene functions. Moreover, the separation of terminal inverted repeats by inverting the chromosomal region between two transposable elements resulted in immobilization. This is of a particular interest for applied transgenesis approaches in insect pest management, when transgenic insects will be released into the nature and transposable elements must be efficiently protected from potential cross mobilization in host species.
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Die Bedeutung von endogenem und künstlichem Auxin für die Kultivierung photoautotropher Zellen von Chenopodium rubrum
(2005)
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Oscar Carlos Valdes Dominguez
- Das Ziel dieser Arbeit war die Klärung der Bedeutung von endogenem (IES) und künstlichem Auxin (2,4-D) für das Wachstum der photoautotrophen Chenopodium rubrum-Zellkultur. Das Cytokininspektrum dieser Zellen und die Ethylenproduktion einer Suspensions-Batchkultur war bereits über den ganzen Verlauf von ca. 100 Tagen eingehend untersucht worden, über die endogenen Auxinverhältnisse lagen jedoch keine Daten vor. Die Quantifizierung der IES-Konzentration erfolgte dann mit Hilfe des ELISA nach Weiler (1986). Mit der optimierten Methode wurde der Auxingehalt während der gesamten Kulturperiode gemessen. Zu Beginn der Kultur (4.Tag) durchläuft die endogene Konzentration an IES einen kurzzeitigen, aber besonders ausgeprägten Peak, wobei die Konzentration bereits in der Teilungsphase wieder auf einen niedrigen Wert abfällt. In der stationären Phase nimmt die Auxinkonzentration vorübergehend, aber längst nicht so stark wie am Anfang, zu, fällt zum Beginn der Seneszenz wieder ab, und steigt dann in der Schlussphase erneut deutlich an. Der endogene Auxingehalt steht aber auch unter dem Einfluss von exogen angebotenen 2,4-D (Dichlorphenoxyessigsäure). Um einen Beitrag zum Verständnis der Auxinwirkung auf molekularer Ebene zu leisten, wurde zunächst die Aufnahme von exogenem Auxin in die Zellen untersucht. Die Zellen nehmen Auxin sehr schnell und (fast) vollständig aus dem Medium auf. Nun konnte mit Hilfe des Differential Display-Verfahrens gezielt nach Genen gesucht werden, die durch IES induziert werden. Mit diesem Verfahren wurden 3 Genfragmente aufgefunden, deren Expression durch IES induziert wurde. Durch Screenen von cDNA-Banken von Chenopodium rubrum wurden die zugehörigen Gene gefunden: 18R10 (cDNA-Bank aus 35 Tage alten Zellen), A1.1 und Alt6m4 (cDNA-Bank aus 35 Tage alten Zellen nach 2stündiger IES-Behandlung). Das Gen A1.1 wird durch IES, nicht aber durch 2,4-D induziert. Es handelt sich um ein Gencluster, das zwei Proteine codiert - das ribosomale Protein S2 (RPS2) und die Untereinheit IV der ATPase. Im Northern-Blot-Verfahren wurde eine mRNA aus Chenopodium rubrum-Kulturzellen detektiert, die mit der die ATPase-Untereinheit codierenden cDNA aus A1.1 hybridisierte. Da diese mRNA durch die Bindung an eine Oligo-dT-Säule isoliert wurde, muß sie einen Poly-A-Schwanz besitzen und somit aus der Transkription des Kerngenoms stammen, da plastidische mRNA keinen Poly-A-Schwanz aufweist. Ein die ATPase-Untereinheit-codierendes Gen sollte daher auch im Kern der Chenopodium rubrum-Zellen vorkommen, das grosse Ähnlichkeit mit dem entsprechenden cDNA-Bereich des plastomischen A1.1 hat. Die Bildung dieser mRNA wurde duch IES-Behandlung induziert. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass nicht nur die Chloroplasten, sondern auch der Kern der Chenopodium rubrum-Zellen ein ATPase-Untereinheit-codierendes Gen besitzt, dessen Expression durch Auxin induziert werden kann. Das Gen 18R10 codiert eine Lipase mit dem für Phospholipasen typischen GDSL-Motiv. Die Sequenz ist 368 Aminosäuren lang. Eine Hydrophobizitätsindex-Analyse mit Hilfe des TMHMM-Programms ergab, dass die GDSL-Lipase von Chenopodium rubrum ein transmembranes Protein ist. Dabei befindet sich der N-Terminus (12 Aminosäuren) im Zellinneren und ist über einen transmembranen Anker von 19 Aminosäuren an die Zellmembran gebunden. Der größte Teil des Proteins ist extrazellulär (Aminosäuren 32-368), darunter auch das aktive Zentrum. Interessanterweise wurde die Expression dieser Lipase durch IES induziert, aber durch Cytokinin gehemmt. Ein Antagonismus beider Phytohormone wurde auf Genexpressionsebene bisher noch für kein anderes Gen beschrieben. Das Gen Alt6m4 wird nicht in Zellen der Teilungsphase (7 Tage), sondern nur in Zellen der stationären Phase (35 Tage) exprimiert und seine Expression wird durch IES, nicht aber durch 2,4-D induziert. Die Sequenz ist 2692 bp lang, mit einem offenen Leseraster zwischen den Basenpaaren 59-2362. Das entsprechende Protein ist eine ß-Xylo-Glucosidase, die zur Glycosyl-Hydrolase-Familie 3 gehört und 767 Aminosäuren enthält. Um die zellphysiologische Bedeutung dieses Gens zu ermitteln, wurde eine knock-down-transformante (RNAi) Zelllinie hergestellt. Dafür musste ein Transformations- und Selektionssystem für die Chenopodium rubrum-Suspensionskultur entwickelt werden. Die stabile Transformation gelang schließlich durch Partikelbeschuss und Selektion mit Kanamycin. Die Transformante konnte über eine Kalluskultur wieder als Suspensionskultur etabliert werden. Sie wächst erheblich schlechter als der „Wildtyp“ und auch als die Null-Transformante und altert schneller. Die Teilungsfähigkeit dieser Zellen geht schon am 50.Tag der Kultur verloren. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit dem Befund, dass das Gen im „Wildtyp“ in der stationären Phase (Tag 30 – 60) am stärksten exprimiert wird.
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Synthese, Charakterisierung und Reaktivität von Platin(II)-Komplexen mit Cycloheptatrienylphosphan-Liganden
(2005)
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Bettina Ullmann
- Tri(1-cyclohepta-2,4,6-trienyl)phosphan P(C7H7)3 (1) kann als ein mehrzähniger Ligand fungieren, da es sowohl über das Phosphoratom als auch über die mittlere Doppelbindung der Siebenringe an ein Zentralmetall koordinieren kann. Dabei war in Komplexen, bei denen das Phosphan zweizähnig gebunden ist, dynamisches Verhalten bezüglich der Koordination der Doppelbindung zu beobachten. Deshalb erschienen die NMR-Signale gemittelt und zum Teil sehr breit. Zusätzlich wurde die Reaktivität dieser Komplexe durch die dynamischen Prozesse eingeschränkt. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit neue Cycloheptatrienylphosphane synthetisiert werden, die zweizähnig an das Platin gebunden sind und geringe Dynamik zeigen. Ein Vertreter solcher Phosphane ist das Cycloheptatrienyl(diphenyl)phosphan Ph2P(C7H7) (3), welches über einen optimierten Syntheseweg hergestellt werden konnte. Bei der Darstellung zwei neuer Phosphane, dem MeP(C7H7)2 (6) und dem Me2P(C7H7) (8), wurde genutzt, dass Cycloheptatrienylphosphoniumsalze durch eine reduktive Eliminierung von Tropyliumbromid mit anschließender Umsetzung mit LiAlH4 stets wieder in ein Phosphan zurückgeführt werden können. Deshalb wurde 1 mit Methyliodid versetzt und anschließend ein C7H7-Ring eliminiert. Durch nochmaliges Umsetzen von 6 mit Methyliodid und anschließender Reduktion erhält man das Dimethyl(cycloheptatrienyl)phosphan (8), das nur einen Siebenring enthält und dadurch fest an das Platin koordiniert. MeP(C7H7)2 (6) ist ein anschauliches Beispiel für 1H- und 13C-NMR-Spektren von diastereotopen =CH-Einheiten des Siebenringes. Neben der Verwendung der Phosphane als Liganden wurden sie mit den elementaren Chalkogenen, O, S, Se, zu Chalkogeniden umgesetzt. Um schließlich die Koordinationschemie der drei dargestellten Phosphane 3, 6 und 8 zu untersuchen, wurde (cod)PtCl2 mit dem entsprechenden Phosphan versetzt (12, 14, 15). Dadurch wird cod durch einen Cycloheptatrienylphosphanliganden substituiert. Die Phosphane koordinieren über das Phosphoratom und über die mittlere Doppelbindung des Siebenringes an das Metall. Wie erwartet zeigen die C7H7-Ringe von 3 und 8 keine dynamischen Prozesse in ihren Platinkomplexen. Die Molekülstruktur für 12 wurde mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Dagegen zeigt 14 in den 1H- und 13C-NMR-Spektren wie [(C7H7)2P(C7H7)]PtCl2 (2) nur gemittelte Signale. Wird das Phosphan 3 im zweifachen Überschuss zum (cod)PtCl2 gegeben, wird der Diphosphankomplex mit zwei einzähnig koordinierten Phosphan-Liganden erhalten, welche cis-ständig am Platin gebunden sind. Wie bereits für 2 beschrieben, ist es möglich, den zum Phosphor-Atom cis-ständigen Chloro-Liganden durch eine Alkinylgruppe zu substituieren. Die Umsetzung von 2 mit Me2Sn(CCR)2 bei Raumtemperatur führt interessanterweise zu Di(alkin-1-yl)platin-Komplexen. Vorher mussten diese über eine Zwischenstufe, dem (cod)Pt(CCR)2, dargestellt werden. Der kristalline Komplex 22 wurde mittels Röntgenstrukturanalyse charakterisiert. Für die Reaktionen mit MeLi wurde die Synthese der Komplexe [(C7H7)2P(C7H7)]PtCl(CCR) wiederholt. Dabei konnte für 27 (R = SiMe3) ein Einkristall erhalten werden, der für eine Röntgenkristallstrukturanalyse geeignet war. Der Chloro-Ligand sollte leicht über Substitutionsreaktionen ersetzt werden können. Allerdings wurden mit MeLi nur Produktgemische erhalten, und diese Produkte wurden mithilfe von verschiedenen NMR-Versuchen charakterisiert. Die Produktverteilung zeigt an, dass die Reaktion unter nucleophiler Addition des Methylanions und anschließender Eliminierung von LiCl, MeLi oder LiCCR abläuft, wobei das Letztgenannte dann auch an der Reaktion teilnimmt. Bei der Umsetzung von 27 mit einem Überschuss an MeLi wird ein weiteres Produkt (44) erhalten, welches an der CC-Gruppe methyliert wurde und durch Röntgenstrukturanalyse charakterisiert werden konnte. Die 1,1-Organoborierungsreaktionen der Alkin-1-yl(chloro)platin-Komplexe laufen sehr langsam bis gar nicht ab. Ein möglicher Grund dafür ist, dass der Alkinyl-Rest trans zur Olefin-Einheit steht. Sie übt im Vergleich zum Phosphor-Atom offenbar einen geringeren trans-Einfluss aus und die Pt-C-Bindung ist für die Organoborierungsreaktion nicht hinreichend polar. Aufgrund des höheren trans-Einflusses des Phosphor-Atoms reagieren die Di(alkin-1-yl)platin-Komplexe an der zum Phosphor trans-ständigen Alkinyl-Gruppe mit BEt3. Dabei entstehen mehrere neue Verbindungen, von denen bisher nur wenige charakterisiert werden konnten. Ein solches Produkt ist 21A, für das zahlreiche NMR-Daten vorliegen. Wenn der Alkinyl-Rest mit einer Trimethylsilyl-Gruppe substituiert ist, kommt es zur Bildung zweikerniger Komplexe (22D, 43D), welche interessante NMR-Spektren liefern. Die spektroskopischen Untersuchungen der Umsetzung von 2 mit LiSnMe3 liefern für ein Produkt sehr komplizierte NMR-Spektren, da sich hier vermutlich ein Platin(II)-Komplex (46) mit vier Stannyl- und einem Phosphan-Liganden bildet.
