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Linking behaviour and physiology of female bonobos (Pan paniscus)
(2005)
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Karin Reichert
- The present study investigates sexual behaviour and the importance of dominance in female bonobos. Detailed behavioural studies were carried out on four mixed-sex captive bonobo groups; morphological data and faecal samples were collected to allow non-invasive assessment of physiological parameters. First, I addressed the background for the variability in patterns of menstrual and swelling cycles in bonobos. The duration of menstrual intervals was influenced by reproductive history. Menstrual cycles and phases of maximum tumescence of the sexual swelling lasted longer in lactating females. Parity did not influence cycle patterns. Further, the variability of the duration of intermenstrual intervals was found to be mainly caused by variability in follicular phase length. The luteal phase, contrastingly, was much less variable and did not influence the length of intermenstrual intervals. This raises the question whether sexual swellings serve as a reliable indicator of ovulation in bonobos. Hormone analyses showed that the day of ovulation could not be predicted from the onset of maximum tumescence. Also detumescence of the swelling was no clear sign that ovulation had occurred. Nonetheless, sexual interactions were found to vary according to the degree of tumescence, being most frequent at maximum tumescence. The frequency of sexual interactions did not change in the peri-ovulatory phase and no difference between was seen between follicular and luteal phase. This indicates that sexual swellings are not a reliable signal of ovulation. Rather, they could be a graded signal that advertises the probability of ovulation which allows females to follow a mixed strategy of confusing and biasing paternity. Next, the context and function of same-sex sexual interactions among female bonobos were investigated. Genital rubbing took place more often between non-related than between related females. Females were able to get hold of and defend monopolisable food items without the help of other females in feeding experiments. No relationship between genital rubbing and food sharing was found and no female-female coalitions were formed during these experiments. Interventions in conflicts outside the feeding experiments were observed mainly in heterosexual conflicts but females supported each other irrespective of preferences for genital rubbing. The frequency of genital rubbing did not vary in dependence of the degree of genital swelling and the solicitation of genital rubbing was not asymmetric in dependence of the relative degree of swelling of the two partners. The degree of tumescence did not influence the frequency of received or overall aggression for a female. Although most female dyads were involved in same-sex conflicts, genital rubbing was observed in less than half of the dyads after the conflict. No increase of gg rubbing occurred 15 minutes after a conflict compared to 15 minutes before. High-ranking females took the male position during genital rubbing significantly more often than low ranking ones. The direction of initiation of genital rubbing was not influenced by social status. The data do no support the hypothesis that genial rubbing serves to form or maintain alliances, to reduce competition among females or to reconcile former opponents. However, genital rubbing may be a display of social status or may serve to reduce tension. Finally, the correlation of physiological parameters and social status in female bonobos was studied. I investigated whether females differ in their excretion pattern of the glucocorticoid 11-ketoetiocholanolone (DOA) in dependence of their social status. Based on displacements, females were categorised to either high or low social status. During the feeding experiments carried out on one group, high social status transferred in access to monopolisable food, the low ranking female was not successful in monopolising the food item. However, female social status was not reflected in the faecal excretion pattern of glucocorticoid metabolites in any of the three groups analysed. In two groups the high-ranking individuals had higher levels of iDOA than low-ranking individuals, in the other group it was vice versa. The fourth group did not allow this investigation as the high ranking individual was pregnant and pregnancy was found to result in elevated glucocorticoid levels. The results indicate that also in bonobo females, high social status translates into better access to monopolizable resources. Status dependent differences in cortisol excretion may not exist in bonobos or may become obvious only during periods of social instability. Alternatively, social status may not influence adrenocortical function but other physiological parameters of the so-called stress axes. Taken together, this study provides an interdisciplinary view on bonobo female behaviour and physiology helping to better understand the adaptive significance of a species’ social and mating system.
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Analyse der Funktion und Regulation des ECF-Sigmafaktors YlaC aus Bacillus subtilis
(2005)
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Stephan Zellmeier
- Alternative Sigmafaktoren mit extracytoplasmatischer Funktion (ECF-Sigmafaktoren) repräsentieren eine sich kontinuierlich vergrößernde Gruppe an Regulatorproteinen, die an der differentiellen Genexpression in Bakterien beteiligt sind. Obwohl Gene, welche durch diese Regulatorproteine kontrolliert werden, ebenso wie die Regulationsmechanismen noch weitgehend unaufgeklärt sind, scheinen ECF-Sigmafaktoren in Bakterien eine Schlüsselrolle im Bereich der Stressantwort, der Differenzierung und der Pathogenese zu spielen. In dem Gram-positiven Modellorganismus B. subtilis konnten bislang sieben Gene mit Ähnlichkeiten zu ECF-Sigmafaktoren identifiziert werden (sigX, sigW, sigM, sigY, sigV, sigZ und ylaC), wobei hauptsächlich sigX, sigW und sigM im Zentrum durchgeführter Untersuchungen standen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der potentielle ECF-Sigmafaktor YlaC hinsichtlich seiner Funktion und Regulation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ylaC Teil eines tetracistronischen Operons ist und mit dem Gen seines möglichen Anti-Sigmafaktors kotranskribiert wird. Zusätzlich kodiert das Operon für zwei weitere Membranproteine mit bislang unbekannter Funktion. Obgleich kein spezifischer Stressfaktor identifiziert werden konnte, wurde die positive Regulation des ylaA-Operons durch YlaC eindeutig gezeigt. Die Ergebnisse einer globalen Transkriptionsanalyse deuten darauf hin, dass YlaC ausschließlich sein eigenes Operon reguliert. Durch Primer-Extension konnte der Transkriptionsstartpunkt des ylaA-Operons bestimmt werden. Die ermittelte Promotorsequenz ähnelt bereits identifizierten Promotorsequenzen von ECF-Sigmafaktoren aus B. subtilis. Die für den ylaA-Promotor ermittelte Sequenz konnte vor keinem anderen Ges des B. subtilis-Genoms gefunden werden. Durch Northern-Blots und b-Galaktosidase-Tests mit einem DylaD-Stamm wurde gezeigt, dass YlaD als Anti-Sigmafaktor von YlaC wirkt. Gereinigtes YlaD bindet Zink in äquimolaren Mengen und wird deshalb einer neu-definierten Familie von Zink-bindenden Anti-Sigmafaktoren zugeordnet. YlaD ist ein Membranprotein, dessen C-terminus in der Cytoplasmamembran verankert ist. Nach Überexpression konnte YlaD in Western-Blots nur dann nachgewiesen werden, wenn das yluC-Gen, welches für eine intramembrane Protease kodiert, deletiert war. Eine YluC-Variante mit einer Mutation im aktiven Zentrum war nicht mehr in der Lage, das sW-Regulon aus B. subtilis zu aktivieren. In einer DyluC-Mutante reicherten sich auch verkürzte Formen der SigX und SigM Anti-Sigmafaktoren an, was auf eine generelle Rolle von YluC bzw. von intramembraner Proteolyse bei der Regulation von ECF-Sigmafaktoren in B. subtilis hindeutet. Eine mögliche Funktion der bislang uncharakterisierten Membranproteine YlaA und YlaB bei der Regulation der YlaC-Aktivität wurde durch die Konstruktion von Reporterstämmen, welche verschiedene Kombinationen aller vier Gene des ylaA-Operons enthielten, analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von YlaB einen Einfluss auf die Anti-Sigmafaktor-Aktivität von YlaD hat. Durch Western-Blots war ein stabilisierender Einfluss von YlaB auf YlaD nachweisbar. Eine direkte Interaktion zwischen YlaB und YlaD konnte durch in vitro-Experimente gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YlaD, zusammen mit YlaB und eventuell auch mit YlaA, Teil eines membrangebundenen Proteinkomplexes ist, der YlaD vor dem Abbau durch YluC schützt.
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Pollination Biology of Gentianales in a Southern Ecuadorian Montane Forest
(2005)
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Doris Anne Wolff
- The pollination and reproductive biology of mostly small flowered, taxonomically related species of the monophyletic order Gentianales (Apocynaceae including Asclepiadoideae, Gentianaceae, and Rubiaceae) was investigated in a tropical montane forest in southern Ecuador. This study is part of an interdisciplinary project on the diversity and functioning of a montane ecosystem, and provides important results with respect to pollination biology. Such data are rarely collected for such a large number of taxa in a way that permits asking questions concerning both community ecology and evolution. This thesis investigates the contribution of diurnal floral visitors to the reproductive success of the night flowering "sphingophilous" Isertia laevis (Rubiaceae), and discusses the value of pollination syndromes in characterizing the pollinator spectrum of a given plant. Isertia laevis possesses flowers that are morphologically adapted to pollination by sphingids, but diurnal flower observation showed that nine different hummingbirds (Trochilidae) were frequent visitors. At night, only a few sphingid individuals were observed. Pollination experiments showed that flowers exclusively presented to nocturnal pollinators had a low fruit set (14%) but a high seed set (59%). Flowers accessible only to diurnal floral visitors showed a high fruit set of 63%, but a low seed set of 14%. Efficiency of pollination (fruit set X seed set) was equal for both diurnal and nocturnal pollinators. This shows that frequently occurring, but not very effective pollinators contribute substantially to seed production when the expected pollinators are scarce. This study is one of the first examining the pollination biology of Apocynaceae-Asclepiadoideae, tribe Asclepiadeae (other than the temperate genus Asclepias), providing basic information on a plant's reproductive biology, focusing on animal-plant interactions of these mostly twining, highly scattered inhabitants of forests and forest margins, possessing very small, inconspicuous flowers. A large variety of floral visitors was observed on the flowers, however, pollinaria were carried by only four insect species. The flowers showed a comparatively low pollinaria removal rate with an average of 0.32 ± 0.13, and an even lower average was recorded for the pollinia insertion rate at 0.13 ± 0.07. The percentage of inserted pollinia to removed pollinaria was comparatively high with an average of 42.7% ± 22.3%. This shows that if an insect achieves pollinia transfer, it does so very effectively. The derived floral structure and pollinating system in the Apocynaceae-Asclepiadoideae has often been characterized as a very close flower-pollinator interaction. The present study, however, suggests limited specialization, with some degree of generalization. Sucrose is the predominant floral nectar sugar in the order Gentianales (although the order possesses flowers morphologically adapted to ornithophily, sphingophily, chiropterophily, melittophily, and myiophily), suggesting that nectar sugar composition is a conservative characteristic. The only significant differences in sugar composition were found in chiropterophilous and myiophilous flowers, which had a significantly lower sugar ratio than sphingophilous flowers. A separation of chiropterophilous and myiophilous flowers from the other pollination syndromes was further substantiated by non-metric, multidimensional scaling using the CNESS index of dissimilarity, based on nectar sugar compositions. Further, matrix tests revealed no correlation of observed floral visitors to nectar concentrations, whereas a weak significant correlation was found between floral visitors and nectar sugar compositions. Therefore, some degree of adaptive convergence of floral nectar compositions to principal pollinator type within the constraints set by phylogenetic history is likely. Matrix tests revealed a correlation between floral visitors and nectar volume of covered flowers, and to a lesser extent, of uncovered flowers. The nectar volumes of covered and uncovered flowers were related to, and differ significantly among, pollination syndromes. Therefore, the driving force to visitation appears to be the volume of nectar the visitor can expect to consume. A phylogenetic study of Arcytophyllum (Rubiaceae) based on Internal Transcribed Spacer (ITS) was conducted and compared with an earlier study based on cpDNA. To understand the expression of heterostyly in the genus, we analyzed the inter- and intraspecific variation in floral morphology, nectar, pollen-ovule ratio, and seed set of ten species in eleven populations. Stigma and anther levels differed significantly between the morphs in the species/populations investigated except in A. filiforme. Different expressions of heterostyly in Arcytophyllum seemed independent of phylogenetic relationships, however, there was a tendency towards a higher percentage of sucrose in the more derived species of the genus. Nectar sugar composition was similar between the morphs. Pollen dimorphism, both with regard to number (long-styled > short-styled) and to size (short-styled > long-styled) was observed in all taxa investigated except for A. filiforme. This shows that both features in the expression of heterostyly and the reproductive system may vary among closely related species.
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Water use of forests along elevation gradients in the Berchtesgaden National Park
(2005)
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Olimpia Kolcun
- Forests are major sources of water vapor to the atmosphere and have an important influence on both regional and global climate. Understanding of the water exchange between the vegetation and the atmosphere, and recognition of factors to predict the water fluxes is necessary to estimate the changes in water use according to possible climate change. In this study the processes affecting the transpiration of Norway spruce (Picea abies) in the Berchtesgaden National Park along an elevation gradient were investigated. Sapflow and meteorological measurements were carried out during the summer of 2002. For each stand, structural differences (tree height, circumference, diameter (DBH), tree density, basal area) were also analyzed. For the experiment, three Norway spruce stands – with similar inclination, exposition, LAI and soil conditions, but situated at different elevations a.s.l in the Berchtesgaden National Park were selected. The transpiration rates of spruce were compared with those of other species: Fagus sylvatica, Larix decidua and Pinus mugo. In each stand, six to fifteen trees were selected for sapflow measurements. Xylem sap flux was observed with constant-heating-method according to Granier. Sapflow rates of individual trees were scaled up to the stand level according to the cross-sectional sapwood area of the DBH class (for spruce and beech) or total cross-sectional sapwood area (for larch). Within the sparse Larix decidua stand, both the sapflow in trees and water loss from understory vegetation were measured. Strong correlations between transpiration rates and maximum VPD and daily integrated PPFD were found for the experimental species. For the Norway spruce stands, needle nutrient concentrations were also determined. During the 2002 growing season (May- September), the seasonal patterns of tree canopy transpiration were similar for the different experimental stands. The highest water use was observed in June and July for spruce and dwarf-pine, and in July and August for beech. The seasonal changes in canopy transpiration and conductance, and the variation between spruce stands, may be in part explained by differences in meteorological conditions. Canopy conductance was calculated from canopy transpiration (Ec) and vapor pressure deficit (VPD). Absolute rates of seasonal canopy transpiration within experimental Picea abies sites differed greatly from 78 to 165 mm. The highest transpiration rates occurred in the lowest situated stand and they decreased with increasing elevation. The seasonal water loss from the Fagus sylvatica site (78 mm) was similar to the water loss at the highest situated spruce site. The seasonal transpiration of Pinus mugo site reached 44 mm. Transpiration of Larix decidua was only measured successfully during June and during a few days in July. A strong decrease of canopy conductance (gt) with increasing VPD was observed for all stands. The highest maximum canopy conductance for spruce, 20 mm s-1, was calculated for the 630 m site, while for the 1040 m and the 1360 m sites the maximum gtmax reached 15 mm s-1. In comparison the maximum canopy conductance for the beech site was higher than for the spruce site at the same elevation a.s.l. (630 m) and reached 30 mm s-1. The lowest maximum gt, 10 m s-1, was estimated for dwarf-pine shrub. For the examination of controls on spruce forest water use that were found along the elevation gradient, the GAS-FLUX model was used. Model simulations support two alternative hypotheses, namely that stomatal patchiness as well as carboxylation capacity (Vcmax) may have had an influence on stand water use. The modelled transpiration with changes in Vcmax was similar to estimated transpiration rates obtained by changing the “portion of leaves that are active” (stomatal patchiness). The developed model can be used for estimation of water use for other similar mountainous locations or for examination of ecosystem sensitivities to environmental changes (nitrogen supply, air temperature). The current work should stimulate further research on the detailed study of e.g. stomatal patchiness and its influence on transpiration rates, or to test the results at other sites.
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Diversity and species composition of two different moth families (Lepidoptera: Arctiidae vs. Geometridae) along a successional gradient in the Ecuadorian Andes
(2005)
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Nadine Hilt
- The diversity of two very species-rich families of arctiid and geometrid moths was investigated in a montane area in the Andes in southern Ecuador (Reserva Biológica San Francisco, 3°58´ S, 79°5´ W) along a succession gradient ranging from a barely vegetated landslide area to mature forest understorey between 1,800 and 2,005 m above sea level. This study was part of a larger interdisciplinary project on diversity and functioning of a tropical mountain rainforest ecosystem. Moths were collected during three field periods in the years 2002 (March to April, October to November) and 2003 (August to October) at the 15 succession sites. Moths were manually sampled by attraction to weak light sources (2 x 15 W tubes: black light and super-actinic light) in a white gauze cylinder from 18:45 to 21:45 h. Data from this study (15 succession sites) were compared with data from six natural forest understorey sites sampled in the years 1999 and 2000 in the same region. A total of 9,211 arctiid moths representing 287 species, of which 135 belong to the tribe Phaegopterini, followed by Ctenuchini/Euchromiini (82), Lithosiinae (54), Pericopini (9), and Arctiini (7), as well as 23,720 geometrid moths representing 868 species were recorded at 21 sites. Large proportions of the samples (Arctiidae: 70.4% of species, 76.1% of individuals; Geometridae: 65% of species, 78.1% of individuals) were identified to species level. The study deals with patterns of alpha- and beta-diversity, ensemble structure, wing colouration and various other morphological traits of arctiid moths along the succession gradient. In addition, temporal dynamics of moth ensembles as well as the role of environmental factors such as temperature or habitat openness as predictors of faunal change at small spatial scales were investigated.
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The role of the apoplastic transport barriers for radial water and ion uptake in rice (Oryza sativa L.) and corn (Zea mays L.) roots
(2005)
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Kosala Manjupriya Ranathunge
- For rice, the overall radial hydraulic conductivity (Lpr) was lower than those of other cereal roots. The stele/endodermis, aerenchyma, and the outer part of roots (OPR) arrange in series and their resistances to the overall radial water flow are additive. However, the hydraulic resistance of the OPR was smaller by a factor of 30 than the overall values of root Lpr. Hence, the endodermis rather than the OPR limits water uptake. It appears that the OPR is constructed to provide a substantial barrier for oxygen rather than for water. The latter is transported down to root tips limiting root extension, which resulted to develop small rice root systems. Both cultivars used here (IR64 and Azucena) developed strong barriers to radial oxygen loss (ROL). The rates of ROL dramatically decreased along the root and reached values close to zero in basal parts. The data from this thesis show for the first time that radial uptake of water by rice roots is not limited by the OPR. Theoretical estimations suggested that the endodermis limits the rate of radial water flow and the resistance of the aerenchyma is in between that of the endodermis and the OPR. High values of the LpOPR could be either brought about by a large apoplastic component of water transport or by a high permeability of membranes of the living cells in the OPR or by both together. In order to quantify the relative contribution of the apoplastic vs cell-to-cell paths to the overall LpOPR, apoplastic pores of the OPR were either partially blocked by China ink particles or clogged with copper ferrocyanide precipitates. In another experiment, water channels (aquaporins) of the OPR were blocked with water channel blocker HgCl2. Resulted LpOPR values after the treatments suggested that proportionately greater apoplastic water flow across the OPR compared to cell-to-cell water flow. On average, 66-75% of water used extraprotoplastic path. This finding was further supported by substantial increases of the reflection coefficient of the OPR (ssOPR) after treatments with apoplastic blockers. Strongest evidence in favour of a predominant apoplastic water transport came from the comparison between diffusional (PdOPR, measured with heavy water, HDO) and osmotic water permeability (PfOPR) or hydraulic conductivity (LpOPR). The PfOPR was larger by a factor of 600-1400 than PdOPR. To obtain such huge values of Pf/Pd ratios are expected if the pathway involved a rather long porous path, i.e. a passage along the apoplast; this would offer a high diffusional resistance for HDO, but should be highly permeable in case of a bulk (hydraulic) water flow. Blockage of apoplastic pores with copper ferrocyanide precipitates significantly affected the bulk rather than the diffusive water flow and caused a 3-5-fold reduction of the PfOPR/PdOPR ratios. These findings suggested a prominent apoplastic bypass flow across the OPR of rice. Copper ferrocyanide precipitation technique with roots of rice and corn showed that CBs of the exo- and endodermis were not completely impermeable to Cu2+ ions. When offering Cu2+ and Fe(CN)64- on different sides, brown copper ferrocyanide crystals developed on the side where ferrocyanide was applied. This indicated that positively charged copper ions was moving through the barrier and cell walls, much faster than ferrocyanide with its four negative charges. There was a patchiness in the formation of precipitates, which correlated with the maturation of the exodermis in rice roots. Dense brown precipitates were observed around lateral root emergence points. These places may act as “open doors” for water and apoplastic tracer dyes. To some extent and depending on conditions and developmental state of roots, also ions may move through the apoplast into the xylem and may lead to increase the apoplastic bypass flow in roots. Hydrophobic aliphatic suberin is one of the major chemical compounds in plant roots that may act as an apoplastic barrier to water. To confirm this idea, total amounts of suberin were determined in corn and rice, and compared with their radial hydraulic conductivities. On average, exodermal cell walls of rice contained 6-fold greater aliphatic suberin than in corn hypodermis. In endodermal cell walls, amounts were 34-fold greater in rice than that of corn. Substantially higher amounts of suberin detected in apoplastic barriers of rice corresponded with substantially lower hydrostatic Lpr compared to corn. As the OPR of rice is highly porous and fairly permeable to water, it may argue that this holds true only for the endodermis. The results imply that some caution is required when discussing the role of suberin in terms of an efficient transport barrier for water. The simple view that just the amounts of suberin play the important role may not hold. A more detailed consideration of both the chemical nature of suberins and of the microstructure of deposits is required, i.e. how suberin impregnate wall pores.
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Die Bedeutung von endogenem und künstlichem Auxin für die Kultivierung photoautotropher Zellen von Chenopodium rubrum
(2005)
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Oscar Carlos Valdes Dominguez
- Das Ziel dieser Arbeit war die Klärung der Bedeutung von endogenem (IES) und künstlichem Auxin (2,4-D) für das Wachstum der photoautotrophen Chenopodium rubrum-Zellkultur. Das Cytokininspektrum dieser Zellen und die Ethylenproduktion einer Suspensions-Batchkultur war bereits über den ganzen Verlauf von ca. 100 Tagen eingehend untersucht worden, über die endogenen Auxinverhältnisse lagen jedoch keine Daten vor. Die Quantifizierung der IES-Konzentration erfolgte dann mit Hilfe des ELISA nach Weiler (1986). Mit der optimierten Methode wurde der Auxingehalt während der gesamten Kulturperiode gemessen. Zu Beginn der Kultur (4.Tag) durchläuft die endogene Konzentration an IES einen kurzzeitigen, aber besonders ausgeprägten Peak, wobei die Konzentration bereits in der Teilungsphase wieder auf einen niedrigen Wert abfällt. In der stationären Phase nimmt die Auxinkonzentration vorübergehend, aber längst nicht so stark wie am Anfang, zu, fällt zum Beginn der Seneszenz wieder ab, und steigt dann in der Schlussphase erneut deutlich an. Der endogene Auxingehalt steht aber auch unter dem Einfluss von exogen angebotenen 2,4-D (Dichlorphenoxyessigsäure). Um einen Beitrag zum Verständnis der Auxinwirkung auf molekularer Ebene zu leisten, wurde zunächst die Aufnahme von exogenem Auxin in die Zellen untersucht. Die Zellen nehmen Auxin sehr schnell und (fast) vollständig aus dem Medium auf. Nun konnte mit Hilfe des Differential Display-Verfahrens gezielt nach Genen gesucht werden, die durch IES induziert werden. Mit diesem Verfahren wurden 3 Genfragmente aufgefunden, deren Expression durch IES induziert wurde. Durch Screenen von cDNA-Banken von Chenopodium rubrum wurden die zugehörigen Gene gefunden: 18R10 (cDNA-Bank aus 35 Tage alten Zellen), A1.1 und Alt6m4 (cDNA-Bank aus 35 Tage alten Zellen nach 2stündiger IES-Behandlung). Das Gen A1.1 wird durch IES, nicht aber durch 2,4-D induziert. Es handelt sich um ein Gencluster, das zwei Proteine codiert - das ribosomale Protein S2 (RPS2) und die Untereinheit IV der ATPase. Im Northern-Blot-Verfahren wurde eine mRNA aus Chenopodium rubrum-Kulturzellen detektiert, die mit der die ATPase-Untereinheit codierenden cDNA aus A1.1 hybridisierte. Da diese mRNA durch die Bindung an eine Oligo-dT-Säule isoliert wurde, muß sie einen Poly-A-Schwanz besitzen und somit aus der Transkription des Kerngenoms stammen, da plastidische mRNA keinen Poly-A-Schwanz aufweist. Ein die ATPase-Untereinheit-codierendes Gen sollte daher auch im Kern der Chenopodium rubrum-Zellen vorkommen, das grosse Ähnlichkeit mit dem entsprechenden cDNA-Bereich des plastomischen A1.1 hat. Die Bildung dieser mRNA wurde duch IES-Behandlung induziert. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass nicht nur die Chloroplasten, sondern auch der Kern der Chenopodium rubrum-Zellen ein ATPase-Untereinheit-codierendes Gen besitzt, dessen Expression durch Auxin induziert werden kann. Das Gen 18R10 codiert eine Lipase mit dem für Phospholipasen typischen GDSL-Motiv. Die Sequenz ist 368 Aminosäuren lang. Eine Hydrophobizitätsindex-Analyse mit Hilfe des TMHMM-Programms ergab, dass die GDSL-Lipase von Chenopodium rubrum ein transmembranes Protein ist. Dabei befindet sich der N-Terminus (12 Aminosäuren) im Zellinneren und ist über einen transmembranen Anker von 19 Aminosäuren an die Zellmembran gebunden. Der größte Teil des Proteins ist extrazellulär (Aminosäuren 32-368), darunter auch das aktive Zentrum. Interessanterweise wurde die Expression dieser Lipase durch IES induziert, aber durch Cytokinin gehemmt. Ein Antagonismus beider Phytohormone wurde auf Genexpressionsebene bisher noch für kein anderes Gen beschrieben. Das Gen Alt6m4 wird nicht in Zellen der Teilungsphase (7 Tage), sondern nur in Zellen der stationären Phase (35 Tage) exprimiert und seine Expression wird durch IES, nicht aber durch 2,4-D induziert. Die Sequenz ist 2692 bp lang, mit einem offenen Leseraster zwischen den Basenpaaren 59-2362. Das entsprechende Protein ist eine ß-Xylo-Glucosidase, die zur Glycosyl-Hydrolase-Familie 3 gehört und 767 Aminosäuren enthält. Um die zellphysiologische Bedeutung dieses Gens zu ermitteln, wurde eine knock-down-transformante (RNAi) Zelllinie hergestellt. Dafür musste ein Transformations- und Selektionssystem für die Chenopodium rubrum-Suspensionskultur entwickelt werden. Die stabile Transformation gelang schließlich durch Partikelbeschuss und Selektion mit Kanamycin. Die Transformante konnte über eine Kalluskultur wieder als Suspensionskultur etabliert werden. Sie wächst erheblich schlechter als der „Wildtyp“ und auch als die Null-Transformante und altert schneller. Die Teilungsfähigkeit dieser Zellen geht schon am 50.Tag der Kultur verloren. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit dem Befund, dass das Gen im „Wildtyp“ in der stationären Phase (Tag 30 – 60) am stärksten exprimiert wird.
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Experimenteller Biologieunterricht zu Aspekten der Gentechnik im Lernort Labor: empirische Untersuchung zu Akzeptanz, Wissenserwerb und Interesse
(2005)
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Franz-Josef Scharfenberg
- Basierend auf Überlegungen im Rahmen der entwicklungsorientierten Evaluationsforschung wurde für den außerschulischen Lernort Labor ein Experimentalunterricht zu zentralen Aspekten der Gentechnik mit vier Schülerexperimenten entwickelt und im Rahmen von Projekttagen eingesetzt: - Bakterien-Transformation mit einem rekombinierten, GFP-codierenden Plasmid, - Isolierung der Plasmid-DNA aus den transformierten Bakterien, - Charakterisierung der Plasmid-DNA mit ausgewählten Restriktionsenzymen, - Visualisierung der DNA-Proben über eine Agarose-Gelelektrophorese. Die Experimente zeigten ein hohes Maß an Authentizität und waren mit einer Reflektionsphase zu ethischen Aspekten der Gentherapie verknüpft. In einem Kontrollgruppen-Design wurden die Wirkungen der unabhängigen Variablen Lernort und selbsttätiges Experimentieren auf die Konstrukte Akzeptanz, Wissenserwerb und Interesse an gentechnischen Fragestellungen überprüft. Mögliche Testeffekte wurden über eine externe Kontroll-Gruppe ohne Intervention kontrolliert. An der Studie waren insgesamt 363 Gymnasiasten (12. Jgst.) aus 29 Biologie-Leistungskursen beteiligt. Als Erhebungsinstrument wurde ein informeller Test entwickelt und über eine Voruntersuchung an 172 Schülern (12 Kurse) optimiert. Das Erhebungsinstrument wurde in einem Prä-Posttest-Design mit Follow-up-Test eingesetzt. Aus den Testdaten wurden Kennwerte zur Akzeptanz, dem Wissenserwerb und dem Interesse berechnet und nach der quantitativen Testtheorie bzw. in Bezug auf den Wissenserwerb zusätzlich über die latente Klassenanalyse im Hinblick auf Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen ausgewertet. Die beiden unabhängigen Variablen zeigten folgende Einflüsse auf die drei erfassten Konstrukte: Die aktuelle und die rückblickende Akzeptanz des Experimentalunterrichts im Lernort Labor waren insgesamt sowie auf der Ebene der beiden identifizierten Faktoren „Affektive Bewertung“ und „Bewertung des instrumentellen Handelns“ signifikant höher als die eines vergleichbaren nicht experimentellen Unterrichts, unabhängig von dessen Lernort. Inhaltlich gründete sich diese Akzeptanz primär auf die durchgeführten Experimente, während in den nicht experimentellen Gruppen fachliche, methodische und lehrerbezogene Aspekte entscheidend waren. In der Laborsituation, unabhängig vom Experimentieren, zeigten insbesondere schlechtere Schüler eine höhere Akzeptanz. Die latente Klassenanalyse differenzierte den Subtest Wissenserwerb inhaltlich in „Vorwissen-Items“ und „projektbezogene“, d.h. auf neue Lerninhalte bezogene Items und die Probanden in entsprechend unterschiedliche Lerner-Typen. Die Schüler aller Unterrichtsgruppen erwarben insgesamt und projektbezogen Wissen, vorwissenbezogen jedoch nur im Lernort Labor. Ein Teil des Wissens blieb persistent erhalten, ein anderer Teil wurde wieder vergessen. Die Förderung des Wissenserwerbs im Lernort Labor verdeutlichten zusätzlich ein signifikant höherer Lerner-Anteil gegenüber dem Lernort Schule und das Fehlen bzw. nur teilweise Vorhandensein von positiven Korrelationen von Lernleistungen im Test mit vorherigen schulischen Leistungen. Der aktuelle Lernerfolg war in der Experimentalsituation insgesamt sowie in der nicht experimentellen Laborsituation vorwissenbezogen signifikant höher als in der Schulsituation. Die besondere Bedeutung des vorhandenen Vorwissens für die Experimental-Gruppe wurde durch deren signifikant höheren Anteil an Projektwissen-Lernern und die nur für diese Gruppe feststellbaren positiven Korrelationen von Lernleistungen und der unterrichtlichen Experimentiererfahrung über Lehrerdemonstrationsexperimente sichtbar. Andererseits war das nachträgliche Vergessen insgesamt und projektbezogen in der Experimentalsituation signifikant stärker als in der Schulsituation. Die Ergebnisse deuten zum einen eine mögliche Erhöhung der Lernmotivation im Lernort Labor an, weiter gesteigert durch das Experimentieren, zum anderen stehen sie im Einklang mit der Cognitive-Load-Theorie, in dem sie auf u.U. höhere unterrichtsbezogene Belastungen der Schüler in der Experimentalsituation hinweisen. Das insgesamt schon hohe Interesse differenzierte sich inhaltlich in Interesse an „Anwendungen der Gentechnik beim Menschen“ und in der „Grünen Gentechnik“ sowie an deren „ethischen Aspekten“. Nur bei den Mädchen war in der Experimental-Gruppe die Abnahme des Gesamtinteresses signifikant gegenüber dessen Stabilität in den nicht experimentellen Gruppen (unabhängig vom Lernort). Entsprechend war in der Experimentalsituation das stabile Interesse an ethischen Aspekten signifikant gegenüber dessen Zunahme in den nicht experimentellen Gruppen. Die vermutete Interesseförderung durch das Experimentieren lässt sich nicht bestätigen. Konsequenzen im Hinblick auf den unterrichtlichen Einsatz von Lehrerdemonstrationsexperimenten, die schulische Vorbereitung von Schülerlabor-Besuchen und die Bedeutung eines unterrichtlichen Rahmens im Lernort Labor werden abgeleitet.
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Development of broadly applicable transgenic tools for the transposon mutagenesis of the red flour beetle, Tribolium castaneum
(2005)
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Ivana Viktorinová
- The discovery of non-species-specific, broad-range transposable elements and the establishment of a universal 3xP3 promoter revolutionized insect transgenesis. It overcame the limitations of the germ-line transformation to be restricted to the model organism Drosophila melanogaster. In combination with discernable fluorescent markers, multi-component systems, such as transposon-based insertional mutagenesis, can now be introduced to various insect species. To drive the transposase gene for transposable element remobilisation, suitable promoters are needed. The broadly conserved thermotolerance factor, Hsp70, is well-characterised in D. melanogaster and its promoter, which is inducible by high temperatures, provides a genetic tool for transient gene activation. In this thesis, I could prove that the D. melanogaster hsp70 promoter is functional in Tribolium castaneum as well. Its observed basal level activity, however, must be considered and limits its use for experiments, where no strict transient gene expression is required. Nevertheless, the D. melanogaster hsp70 promoter will suffice to provide an efficient transposase source in transposon-based mutagenesis screens in T. castaneum. The remobilization of non-autonomous transposable elements in such screens results in novel mutations and tagging of potentially interesting cis-regulatory elements. To further investigate gene functions, misexpression studies are necessary. In D. melanogaster, this can be done by directed binary expression systems. Here I could show, that the combination of Gal4delta/UAST works best in D. melanogaster somatic tissue, whereas the LexA/(LL)4 and the tetracycline-controlled systems seem to function only poorly. All constructs are based on broad range transposons as well as universal markers and promoters, so that they can be used in other insect species to determine the best system. Preliminary tests in T. castaneum, however, showed that there are a number of additional problems that need to be addressed, before a suitable binary expression system can be established for this species. The full genome sequence of T. castaneum is now available. Therefore, interesting mutations, cis-regulatory elements and their biological functions can be directly linked to the sequence level. When target sites of site-specific recombination systems are included in insertional mutagenesis screens, their insertion sites can be precisely identified and designed chromosomal rearrangements (inversions, duplications and deletions) created. Here I could present a universal system, which can be introduced into non-drosophilid species and enables such chromosomal rearrangements, which I could successfully demonstrate in D. melanogaster. Defined inversions suppressed meiotic recombination between inverted and non-inverted regions on homologous chromosomes and can thus serve as defined balancer chromosomes. Also defined deletions/duplications were generated in D. melanogaster. Such aberrations will be crucial in other insect species, like T. castaneum, to safely keep mutation stocks and identify gene functions. Moreover, the separation of terminal inverted repeats by inverting the chromosomal region between two transposable elements resulted in immobilization. This is of a particular interest for applied transgenesis approaches in insect pest management, when transgenic insects will be released into the nature and transposable elements must be efficiently protected from potential cross mobilization in host species.
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Zellteilungsregulation meristematischer Wurzelzellen (Tabak BY-2) durch Phytohormone und Zucker
(2005)
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Katja Hartig
- Die Phytohormone Cytokinin und Auxin sind essentiell für die Zellteilungsaktivität in meristematischen Geweben. Trotz ihrer zentralen Bedeutung im pflanzlichen Zellzyklus, ist über deren Bedeutung und Wirksamkeit auf molekularer Ebene bisher nur wenig bekannt. Einige Untersuchungen deuten darauf hin, dass mit Hilfe hormoneller Signale die Zellteilungsaktivität der Meristeme an die physiologischen Gegebenheiten der gesamten Pflanze angepasst wird, und auf diese Weise der Verbrauch an Zucker, die sogenannte Sinkstärke des Meristems definiert wird. Besonders bedeutsam ist deshalb der "cross-talk" der hormonellen Signale mit den metabolischen Signalen. Da diese Signalverknüpfung bisher kaum Ziel wissenschaftlicher Untersuchungen war, sollte diese Arbeit zur Aufklärung betragen. Die Untersuchungen wurden mit einer Tabak Zellkultur (BY-2) durchgeführt, die als Modell eines Wurzelmeristems dienen sollte. Ein Vorteil dieser Zellkultur ist die Möglichkeit, den Zellzyklus der Zellen durch auswaschbare Hemmstoffe synchronisieren zu können. Diese Synchronisierung eröffnet die Möglichkeit, die Effekte von Cytokininen, Auxinen und Zucker auf den Ablauf des Zellzyklus mittels Durchflusscytometrie untersuchen zu können, in dem Qualität und Quantität dieser Faktoren variiert wurde. Parallel dazu wurde die Expression von Zellzyklus-Kontrollgenen mittels semiquantitativer RT-PCR analysiert und entsprechend responsive Gene identifiziert. Ergänzt wurden die Untersuchen der Regulation des Zellzyklus durch längerfristige Beobachtungen der Entwicklung der Zellzahl, des Frischgewichtes und des Volumens der Zellen. Zur Charakterisierung der Signalentstehung, wurden die extrazellulären und intrazellulären Konzentrationen der die Zellteilung steuernden Faktoren gemessen.
