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MAS NMR of Nuclei with Spin S=1/2 in Polycrystalline Powders: Experiments and Numerical Simulations
(2004)
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Matthias Bechmann
- The objective of this work is the examination of one-dimensional magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectra. These spectra serve as a source of spin-system parameters which are related to structural and conformational parameters. It is to show that all spin-system parameters can be derived in a robust and reliable manner. Further on it is investigated how experimental conditions can be optimised in order to determine parameters in a stepwise fashion and get best accuracy for the derived data. This work is dealing with dipolar coupled spin S = 1/2 systems in polycrystalline powdered samples. MAS is used in order to increase spectral resolution and achieve gain in signal-to-noise ratio. However, MAS also causes a substantial down scaling of the information content about the anisotropic interactions of a spin system. A technique to remedy this drawback, while keeping the advantages of MAS, is the use of pulse sequences that reintroduce ("recouple") anisotropic dipolar coupling interactions. To access the spin-system parameters encoded in the lineshapes of MAS NMR spectra an iterative fitting approach is applied. These procedures make numerically exact simulations mandatory and involve accurate calculations of the complete spin-system dynamics. As a consequence all spin-system parameters sensitively encoded in the spectral lineshapes can principally be extracted. Computation of numerically exact simulations can be quite demanding on hardware (CPU speed). The algorithmic implementation of the spin dynamics has significant impact on the time required to simulate a spectrum. Optimisation and clever design of such algorithms is crucial especially when considering the need for repeated simulations in the process of iterative fitting. Usually spin-system size and the complexity of the pulse sequence are the principal factors determining the computation time of a spectrum. The numerical strategy adopted here is applied to one- to four-spin systems where the limiting factor is less the size of the spin system but rather the spin-system characteristics themselves. Spin systems composed of one to four spins have been chosen such that a representative range of spin-system parameters is covered. A combination R² and DQF proved to build robust and reliable experiments making all spin-system parameters accessible to an iterative fitting approach in a usually stepwise manner. The numerical simulations used in this approach additionally can serve for optimising existing pulse sequences. This usually results in better experimental spectra due to a better prediction of optimum experimental setup parameters. Such pre-experiment simulations are especially useful when large CSA interactions are present in dipolar coupled spin systems, a scenario not amenable to a complete theoretical description. Numerically exact simulations can also be regarded as an additional way of designing new pulse sequences. However, there is a certain lack of insight in the physical mechanisms of a pulse sequence when obtained by numerical methods only. For the future it would be useful to improve further the techniques of NMR that give complete and accurate information about local structure. This includes dipolar recoupling experiments of improved selectivity like R²-DQF. But when aiming for the ability to handle larger dipolar coupled spin systems it would also be advantageous to exploit pulse sequences that completely suppress the influence of CSA interactions while maintaining/recoupling the information about dipolar interactions. Further it is important to vary the information content of the spectra, a task for which e.g. OMAS experiments could be used.
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Intact and Damaged DNA and their Interaction with DNA-Binding Proteins: a Single Molecule Approach
(2004)
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Marina Lysetska
- In the present work we study the architecture of intact and damaged DNA and their interaction with DNA-binding proteins using a combination of atomic force microscopy (AFM) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS). In the beginning of this scientific work we therefore focus our efforts on the development of a reproducible protocol for the surface-deposition of different biomolecules, such as linear and circular DNA, different types of proteins and DNA-protein complexes. The analysis of the apparent contour length of intact DNA molecules of different lengths and under different preparation routines is found to be consistent with its B-DNA conformation. In this thesis we report about the first structural study of long DNA molecules that carry UV-light photolesions at random sites. An exposure of DNA to UV light introduces different modifications to the DNA structure: regions of unpaired DNA of different lengths, sharp kinks, the presence of knot like structures and single-strand breaks. In addition, the dynamics of damage accumulation can be traced with AFM. UV-exposure influences both the apparent contour length and the persistence length of the molecules. The structure of UV light damaged DNA strongly depends on the exposure time. Longer UV-light exposure time introduces increasing DNA damage. An FCS study on DNA exposed to UV-light shows that the presence of photoadducts influences the hydrodynamic properties of DNA molecules. The results obtained using both AFM and FCS are compared with gel-electrophoretical experiments. Further, we report about a first AFM study of the hRPA binding properties to intact and damaged DNA. The damage types under investigation were a 6 nt bubble modification, a cisplatin modification as well as lesions induced by UV-light. In our AFM experiment we never find RPA to be bound to the intact dsDNA chain. In complexes with intact DNA human RPA is only found to be bound to the termini of the linear DNA molecules. Human RPA binds with a very low affinity to both DNA containing a 6 nt bubble modification and a single cisplatin modification. Moreover, hRPA showed in this case still a preferential binding to the ends of the linear DNA molecules as seen in the complexes with intact DNA. Because of the low binding strength of hRPA to the cisplatin intrastrand adduct it is easily possible to remove the protein from its DNA complexes by scanning movements of the AFM tip. The images of the DNA molecules after removal of the hRPA proteins show significant distortions of the DNA chain, namely: the separation of the double strand into single-strands resulting in a large region of unpaired bases. Such structures are never observed in images of DNA carrying a cisplatin lesion before the addition of hRPA. This fact may explain a possible role of hRPA in damage excision. Our experiments show a rather high affinity of hRPA to UV-light damaged DNA that increases with UV-light exposition time. The formation of complexes of hRPA and UV-light damaged DNA molecules was studied by both EMSA and AFM. When hRPA was added to the damaged DNA, globular objects sitting on the rod shaped DNA strands were regularly observed in the AFM images. A systematic analysis of the apparent contour length of DNA molecules in protein-DNA complexes reveals a reduction of the contour length in comparison to the one of uncomplexed DNA molecules damaged for the same time. Such reduction of 27.7±7.6 nm suggests a wrapping of the DNA molecule around the hRPA protein. Additionally, using the hRPA-DNA system, we show that the application of the phase signal allows to differentiate between components of similar architecture, but different origin within one AFM image. The last chapter of the thesis is dedicated to the analysis of the DNA-binding properties of ORF80, a novel leuzine protein of unknown physiological role. Our AFM measurements demonstrate that under low protein concentration a specific binding of ORF80 dominates. To the best of our knowledge ORF80 is the smallest protein that was resolved in complexes with DNA by AFM. The single molecule approach in the study of the ORF80 binding properties to DNA with AFM shows that one, at most two ORF80 monomers recognize a specific sequence on the dsDNA. Both AFM and FCS clearly show that higher ORF80 concentrations lead to the formation of big protein-DNA agglomerates that contain numerous DNA and protein molecules. The formation of these agglomerates can be explained both by the unspecific ORF80 binding and its high aggregation properties.
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New Methods for the Investigation of Organic Thin-Film Devices
(2004)
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Helmut Hänsel
- We have developed new techniques for the investigation of organic thin-film devices and have focussed on properties on the molecular scale as well as on macroscopic properties of organic devices. Scanning probe techniques were used to obtain spatially resolved information on morphology and electro-optical properties. Structural changes in composite-based devices were found to have an important influence on device performance. Furthermore, two modes of electroluminescence detection have been developed. Local luminescence detection in the optical near-field by a scanning near-field optical microscope allowed us to monitor the light emission around a dark spot with a resolution better than 134 nm and to observe the electrode ablation. Finally, we have established a new scanning probe technique, named SELM, "Scanning Electroluminescence Microscopy". The simultaneous detection of a PtIr-tip-induced electroluminescence and shear force allows us to distinguish between topography and conductivity. This technique has revealed a strong spatial variation in the electro-optical properties of Alq3 films on ITO substrates. The existing combinatorial preparation method has been supplemented by a variable testing setup that permits the simultaneous investigation of 64 devices under nearly identical conditions. Both OLEDs and photovoltaic cells have successfully been tested over more than 300 hours of continuous operation so that it was possible to study the influence of material combinations and layer thicknesses on the performance and on the degradation of the devices. Variable-angle spectroscopic ellipsometry has been used for the optical characterisation of materials and an automation has been provided for the analysis of combinatorially prepared device arrays. Furthermore, a Mathematica program has been developed for the theoretical description of the short-circuit current in photovoltaic cells. By this means it was possible to explain in detail the observed performance enhancement in heterojunction solar cells, induced by an additional TiO2 layer. The optical and electronic contribution could only be identified by the variation of both layer thickness and device type. The strength of the setup presented is its ability to produce and to test devices under nearly identical conditions and to yield reliable data, which in turn can be used to test physical models. Finally, we have addressed the degradation process of OLEDs. The experiments have shown that inert gas plays an essential role in protecting against degradation, not only by the exclusion of reactive species but also by its heat-transport capabilities. These investigations are only just beginning and further combinatorial studies paired with AFM measurements are currently being developed.
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Hochtemperatursynthese von Smectiten und deren dreidimensional geordnete Einlagerungsverbindungen
(2004)
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Wolfgang Seidl
- Mit Hilfe einer Hochtemperatursynthese bei 1750 °C im geschlossenen System konnte eine Reihe neuer, einphasiger und ladungshomogener 2:1 Schichtsilicate hergestellt werden. Durch Kombination unterschiedlicher isomorpher Substitutionen in den 2:1 Schichtsilicaten zur Generierung der negativen Schichtladung mit verschiedenen Zwischenschichtkationen der Alkali- und/oder der Erdalkalielemente konnte gezeigt werden, dass bei den phasenreinen 2:1 Schichtsilicaten die durch zweidimensionale, planare Defekte verursachte Fehlordnung von der Größe des Zwischenschichtkations und der Art der isomorphen Substitution abhängt. Trotz häufigem Wechsel der Kationenaustauschlösung konnte aber aus zwei Gründen bei keinem aus der Hochtemperatursynthese erzeugten dreidimensional geordneten Schichtsilicat eine vollständige Einlagerung erzielt werden. Zum einen wirkt sich das Aspektverhältnis bei dünnen (<< 1 µm), in der lateralen Ausdehnung sehr breiten Silicatkristallen (> 1 mm), negativ auf die Geschwindigkeit und die Vollständigkeit einer Einlagerungsreaktion aus. Zum anderen behindern die Verwachsungen in den Produkten aus der Hochtemperatursynthese die Einlagerungsreaktion beträchtlich. Durch thermische Nachbehandlung knapp unterhalb des Schmelzpunktes wurde versucht, diese beiden Probleme zu beseitigen. Während beim Cs-Hectorit ein exakter Schmelzpunkt bestimmt werden konnte und nach dem Tempern kaum verwachsene Kristalle mit deutlich höherem Aspektverhältnis erhalten wurden, mussten beim K-Vermiculit aufgrund eines inkongruenten Schmelzverhaltens mehrere Temperversuche durchgeführt werden, die sowohl ein eher lockeres Gefüge von Kristallen als auch einen kompakten, „glasartigen“ Bulk ergaben. Bei Kationenaustauschversuchen der verschiedenen K-Vermiculit-Temperproben mit Ba2+ bei gleichen Reaktionsparametern zeigte der „glasartige“, kompakte Bulk zwar die höchste intrakristalline Reaktivität, aber selbst in dieser Temperprobe konnten die Zwischenschichtkationen nicht vollständig gegen Ba2+ ausgetauscht werden. Dagegen konnte durch das Tempern beim Cs-Hectorit die intrakristalline Reaktivität so weit gesteigert werden, dass nach Optimierung der Austauschbedingungen mit mehreren organischen Kationen dreidimensional geordnete Einlagerungsverbindungen erhalten wurden. Bei zwei dieser Verbindungen (DDABCO-Hectorit und TMA-Hectorit) konnte durch Einkristallstrukturanalyse und -verfeinerung die Anordnung der organischen Kationen im Zwischenschichtraum relativ zu den Silicatschichten bestimmt werden. Beim DDABCO-Hectorit wurde außerdem eine reversible Umorientierung des Zwischenschichtkations in Abhängigkeit von der relativen Feuchtigkeit der Umgebung beobachtet, mit der auch das Entstehen bzw. Ausheilen von planaren Defekten einhergeht. Weil die organischen Zwischenschichtkationen bei diesen beiden Einlagerungsverbindungen mehrere entartete Orientierungen relativ zueinander annehmen können, wurde trotz homogener Schichtladungsverteilung im Röntgenpulverdiffraktogramm nur im Ansatz eine zweidimensionale Fernordnung beobachtet. Dagegen traten bei dreidimensional geordneten Einlagerungsverbindungen des getemperten Cs-Hectorits mit 2H-DABCO2+ und H-MDABCO2+ in den Pulverdiffraktogrammen nach vollständiger Einlagerung deutlich Überstrukturreflexe in Erscheinung. Mit dem getemperten Cs-Hectorit liegt nun erstmals ein dreidimensional geordneter Smectit mit ausreichender intrakristalliner Reaktivität vor, aus dem sich durch Einlagerung mit geeigneten Zwischenschichtkationen dreidimensional geordnete Einlagerungsverbindungen erzeugen lassen. Durch Einkristallstrukturanalyse kann bei den Einlagerungsverbindungen die Struktur des Zwischenschichtraums routinemäßig aufgeklärt werden, was in Zukunft zu einem deutlich besseren Verständnis der Wirt-Gast-Wechselwirkungen im Zwischenschichtraum eines 2:1 Schichtsilicates führen sollte.
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Änderungen intramolekularer Abstände bei der Faltung des Kälteschockproteins aus Bacillus caldolyticus
(2004)
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Christine Magg
- Das kleine Kälteschockprotein Bc-Csp bildet ein beta-barrel aus fünf antiparallelen beta-Faltblattsträngen. Es faltet gemäß einem Zweizustandsmechanismus und erreicht den nativen Zustand in Abwesenheit von Denaturierungsmittel innerhalb einer Millisekunde. Um die strukturellen Veränderungen während dieser schnellen Faltungsreaktion zu untersuchen, wurden intramolekulare Abstandsänderungen mit Hilfe des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) bestimmt. Einzelne Tryptophanreste wurden als Donor und einzelne 5-(((acetylamino)ethyl)amino)-naphthalin-1-sulfonsäure-Reste (AEDANS) als Akzeptor in das Protein eingeführt. An der Oberfläche von Bc-Csp wurden vier verschiedene Donor- und vier verschiedene Akzeptorpositionen ausgewählt. Diese Positionen wurden zu neun einzelnen Donor-Akzeptor Proteinvarianten kombiniert, so daß Änderungen von neun intramolekularen Abständen verfolgt werden konnten. In den nativen Proteinen betrugen diese Abstände zwischen 1,4 und 2,8 nm. Für das Trp/AEDANS Paar liegt der charakteristische Transferabstand im Bereich von 2,2 nm, was ungefähr dem Durchmesser von Bc-Csp entspricht und daher sehr empfindliche Messungen ermöglicht. In den einzelnen Proteinen wurde der Abstand zwischen Donor und Akzeptor sowohl unter nativen als auch unter Entfaltungsbedingungen bestimmt. Für die gefalteten Proteine sind die gemessenen Abstände mit denen aus der Kristallstruktur von Bc-Csp vereinbar, wenn die Länge des AEDANS linker berücksichtigt wird. Bei den entfalteten Proteinen wird eine gute Übereinstimmung mit den berechneten Abständen in einer zufällig angeordneten Peptidkette gefunden. Es gibt daher keinen Hinweis auf nativähnliche Reststrukturen im entfalteten Protein. Die Mutationen und Modifikationen, um sowohl den FRET Donor als auch Akzeptor einzuführen, verringerten die Stabilität von Bc-Csp nur geringfügig und führten zu keiner Veränderung der Rückfaltungsreaktion. Die Änderungen der Transfereffizienz während der Faltung wurden in kinetischen stopped-flow-Experimenten anhand der Trp- und der AEDANS-Fluoreszenz bestimmt. Für diese beiden Sonden wurden reziproke Effekte beobachtet. Bei niedrigen Konzentrationen des Denaturierungsmittels wird bereits in der Totzeit der stopped-flow-Rückfaltungsexperimente ein Anstieg der Transfereffizienz beobachtet, der von einem schnellen Kollaps des entfalteten Proteins verursacht wird. In Abhängigkeit von der Position des Donors und des Akzeptors findet bis zu 70 % der gesamten Abstandsänderung vor dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Faltung statt. Mit Drucksprung- und Temperatursprungexperimenten wird eine höhere Zeitauflösung erreicht, aber der Zeitverlauf des Kollapses konnte auch mit diesen Methoden nicht verfolgt werden. In der Totzeit der Temperatursprungmessungen kommt es zu einer schwachen Effizienzänderung, so daß der Kollaps möglicherweise schneller ist als 0,1 Mikrosekunden. Alle Donor-Akzeptor Proteine zeigen unabhängig vom äußerst schnellen Kollaps ein Zweizustandsverhalten im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Faltung. Es tritt keine Abweichung von der Linearität in den Chevronauftragungen auf, und die kinetischen und die Gleichgewichts-m-Werte stimmen überein. Diese Befunde deuten auf einen kollabierten Zustand hin, der zwar eine kompakte Struktur besitzt, aber für Wasser und Denaturierungsmittel immer noch gut zugänglich ist. Beide Eigenschaften konnten mit Hilfe verschiedener Lösungsmittelzusätze bestätigt werden: Ammoniumsulfat stabilisiert den kompakten kollabierten Zustand, durch Ethylenglykol wird er hingegen destabilisiert. Ethylenglykol wird vom immer noch lösungsmittelzugänglichen Peptidrückgrat des kollabierten Zustands ausgeschlossen. Beim kollabierten Zustand handelt es sich also nicht um ein gut definiertes, teilgefaltetes Intermediat. Der entfaltete und der kollabierte Zustand von Bc-Csp sind wahrscheinlich nicht durch eine Energiebarriere getrennt, sondern bilden zusammen ein Kontinuum von Konformationen mit unterschiedlicher Kompaktheit. Thermodynamisch betrachtet können die kollabierten Moleküle so dem entfalteten Zustand zugeordnet werden. Der Kollaps der Peptidkette ist eine Reaktion auf den Transfer in ein schlechteres Lösungsmittel bei der Rückfaltung. Dieser kollabierte Zustand verzögert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Faltung nicht, und daher erfolgt die effiziente und schnelle Bildung des nativen Zustands von Bc-Csp innerhalb von Millisekunden.
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New block copolymers of Isobutylene by combination of cationic and anionic polymerizations
(2004)
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Nemesio Martínez-Castro
- The studies presented in this thesis deal with the new block copolymers of isobutylene by combination of cationic and anionic polymerizations, which are new materials with numerous promising potential applications. A new method for the synthesis of tailored polyisobutylene(PIB)-based block copolymer by combination of controlled / living cationic and anionic polymerizations has been developed. In addition and parallel to these subjects, new synthetic routes for preparation of telechelic PIBs and conductive polymers have been investigated. The PIB precursors used for subsequent anionic polymerization and other processes were prepared by controlled / living cationic polymerization of isobutylene followed by quenching with thiophene under selected conditions. Quantitative functionalization of living PIB with thiophene (T) has been achieved. The process is complicated by coupling between living PIB and PIB-T formed by in situ deprotonation. By lithiation of PIB-T a new, convenient method has been demonstrated for the synthesis of PIB-based block copolymers, involving anionic initiation of tert-butyl methacrylate. A major improvement is that for an industrial process, lithiation by n-BuLi is much more convenient than metalation by Na/K alloy, which had to be used in former processes. Block copolymers with narrow and unimodal molecular weight distribution (MWD) were synthesized under well-controlled conditions. The lithiated thiophene-capped PIB was also used to prepare four-armed star PIB via chlorosilane coupling. Using the same method, new amphiphilic block copolymers, namely PIB-b-poly(N,N-dimethylacrylamide) and PIB-b-poly(ethylene oxide) were synthesized. The anionic polymerization of N,N-dimethylacrylamide (DMAAm) was carried out with a binary initiator system prepared from thienyllithium and the Lewis acids triethylaluminium (Et3Al), diethylzinc (Et2Zn) or triethylborane (Et3B) in THF. Polymerizations proceeded in a homogeneous manner and gave polymers having controlled molecular weights. However, in presence of alkoxides the polymerization results in polymers insoluble in THF, even using Et3Al. Finally, lithiated PIB-T, in conjunction with Lewis acids, was used to initiate the living anionic polymerization of DMAAm, resulting in the new amphiphilic block copolymer PIB-b-PDMAAm. The anionic polymerization of ethylene oxide (EO) was carried out with a binary initiator system prepared from thienyllithium and the polyiminophosphazene base tBu-P4 in THF. Lithilated PIB-T- in conjunction with tBu-P4 was used to initiate the living anionic polymerization of ethylene oxide. In a second method, PIB-b-PEO was synthesized using hydroxyl end-capped PIB as macroinitiator in conjunction with tBu-P4. The aggregation behavior in dilute aqueous solutions of a PIB-b-PEO copolymer, produced from the combination of cationic and anionic polymerizations, was investigated by dynamic light scattering in aqueous solution. The monoaddition of ethylene oxide to lithiated PIB-T is demonstrated as a new pathway for the synthesis of hydroxy-functional PIB (PIB-OH). This is a useful alternative to the tedious procedures used in the literature so far. PIB-OH was successfully used as a macroinitiator for the ring-opening polymerizations of L-lactide and epsilon-caprolactone catalyzed by stannous octoate. Combination of chromatographic methods and MALDI-TOF ass spectrometry gave information about the side reactions during polymerization. Quantitative functionalization of living PIB with 2-bromothiophene has been achieved. Using various coupling methods, this polymer was convertet to a macromonomer with a pendant thiophene group, which is accessible in the 1- and 5-position. Oxidative copolymerization with thiophene led to graft copolymers consisting of polythiophene-graft-PIB.
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Bestimmung der Struktur der 15. Domäne des Multidomäneninhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie und Design einer inhibitorisch wirksamen Mutante
(2004)
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Klaus Vitzithum
- In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur der 15. Domäne des Multidomänen-Inhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie bestimmt, sowie die inhibitorischen Eigenschaften dieser Domäne untersucht. Das Vorläuferprotein LEKTI (lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor) umfasst fünfzehn Domänen, von denen die 2. und 15. Domäne zwar ein typisches Kazalmotiv zeigen, jedoch anstatt der für klassische Kazalvertreter üblichen sechs 12-13 Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen aufweisen. Bei der schweren autosomal rezessiven Erbkrankheit Netherton Syndrom werden Mutationen im LEKTI-Gen gefunden, die eine vorzeitige Termination der Translation verursachen und daher nur zu verkürzt gebildetem LEKTI-Protein führen. Da die LEKTI-Domäne 15 bei Patienten mit Netherton Syndrom nicht exprimiert wird, ist diese besonders interessant. Einige Symptome des Netherton Syndroms legen eine Fehlregulierung der Proteinase Tryptase nahe, da diese eine Schlüsselrolle bei Überempfindlichkeitsreaktionen und Asthma einnimmt. Bei einem Sequenzvergleich des bislang einzig bekannten natürlich vorkommenden Tryptase-Inhibitors LDTI (leech derived tryptase inhibitor) mit den LEKTI-Domänen wurde eine signifikante Homologie zwischen Domäne 15 und LDTI insbesondere im Bereich der Bindungsschleife gefunden, weswegen eine regulatorische Funktion von LEKTI gegenüber Tryptase vermutet wird. Nachdem kein natürliches Material zur Verfügung stand, war es zur Gewinnung ausreichender Mengen rekombinanten Proteins, wie es für die Bestimmung der Struktur und der inhibitorischen Wirkung erforderlich ist, notwendig, ein geeignetes Expressions- und Reinigungssystem zu entwickeln. Obwohl es inzwischen einige Hinweise auf eine mögliche Prozessierung von LEKTI gibt, ist die natürliche Proteinsequenz der Domäne 15 noch nicht bekannt. Nach Vergleichen mit Kazalvertretern wurde ein 76 Aminosäuren großes Protein (dom15) hergestellt. Wie die strukturelle Charakterisierung ergab, ist dessen COOH-terminaler Abschnitt nicht strukturiert, weswegen eine COOH-terminal verkürzte Variante (dom15kurz) hergestellt wurde, die auch die Auflösung von Mehrdeutigkeiten bei NOE-Kreuzresonanzen erlaubte. Aus den homonuklearen und 15N-editierten NMR-Spektren wurden 887 (dom15kurz) bzw. 908 (dom15) experimentelle Randbedingungen gewonnen, die die Berechnung einer jeweils hochaufgelösten Struktur mit einem RMSD-Wert von 0,5 Å für die schweren Atome des Proteinrückgrats bzw. von 1,0 Å für alle schweren Atome ermöglichten. Beide Varianten zeigen ein typisches Kazal-Strukturmotiv bestehend aus einem dreisträngigen beta- Faltblatt, einer zentralen alpha-Helix und einer exponierten kanonischen Bindungsschleife. Die gegenüber klassischen Kazalvertretern zusätzlichen Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen sind teilweise an der Ausbildung einer weiteren aminoterminalen kurzen Helix und einem hairpin-ähnlichen Motiv beteiligt und so angeordnet, dass der klassische Kazal-Faltungstyp nicht gestört wird. Sowohl die kurze als auch die lange Domäne 15-Variante zeigt eine starke und nicht-temporäre kompetitive Inhibierung von Trypsin und Plasmin bei Werten für die Inhibitionskonstanten im einstelligen nM-Bereich, jedoch keine inhibitorische Wirkung gegenüber Tryptase. Aufgrund des identischen Verhaltens dieser beiden Domäne 15-Varianten gegenüber verschiedenen getesteten Proteinasen ist anzunehmen, dass der COOH-Terminus keinen Einfluss auf die inhibitorische Wirkung der LEKTI-Domäne 15 hat. Außerdem wurde in Anlehnung an LDTI eine Variante der Domäne 15 mit nur einer Aminosäure zwischen den ersten beiden Cysteinen (dom15ldti) hergestellt. Nach oxidativer Rückfaltung zeigte dom15ldti ebenfalls eine starke inhibitorische Wirkung gegenüber Trypsin und Plasmin, wie sie auch für dom15 und dom15kurz beobachtet wurde. Dies deutet auf eine starre Bindungsschleife und ein hoch stabilisiertes Proteingerüst hin. Daher wurde ein Strukturmodell für dom15ldti auf Basis der experimentell bestimmten Struktur von dom15kurz erstellt. Reoxidiertes dom15ldti zeigte eine Inhibierung von Chymotrypsin, Elastase und Subtilisin, während dies weder für dom15 noch für dom15kurz beobachtet wurde. Dies lässt darauf schließen, dass der Bereich zwischen den ersten beiden Cysteinen einen Einfluss darauf hat, welche Proteinase inhibiert wird. Aus Überlagerungen der Strukturen von dom15kurz und der Modellstruktur von dom15ldti mit verschiedenen Proteinase-Inhibitor-Komplexstrukturen kann eine sterische Hinderung als mögliche Ursache für das unterschiedliche inhibitorische Verhalten gegenüber verschiedenen Proteinasen abgeleitet werden. Diese Erkenntnis stellt eine mögliche Grundlage für gezielte Veränderungen einer inhibitorischen Selektivität dar. Außerdem erleichtert die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur der LEKTI-Domäne 15 die Suche nach der immer noch unbekannten Zielproteinase.
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Untersuchungen zur Herstellung strukturierter, nanoporöser Silica – Gele
(2004)
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Annette Fischer
- Nanoporöse Materialien, die über neuartige Synthesewege hergestellt werden, haben in jüngster Zeit vor allem auf speziellen Anwendungsgebieten, wie Membranen, Multilayerbauteilen oder nanostrukturierten Verbundmaterialien verstärkt für Aufsehen gesorgt. Dadurch ist der Sol – Gel – Prozess, insbesondere wegen seiner Möglichkeit sowohl Monolithe als auch dünne Schichten herzustellen in den Blickpunkt des Interesses gerückt. Durch Steuerung der Synthesebedingungen und gezielte Optimierung des Herstellungsprozesses können Porosität und andere Materialeigenschaften variiert werden, denn davon hängen Fließ- und Transporteigenschaften, katalytische Aktivität, Effizienz bei Separationsprozessen oder Adhäsionseigenschaften von Materialien dieser Stoffe ab. So werden beispielsweise akustisches Verhalten und Transporteigenschaften von der Oberflächenstruktur und den vorhandenen Poren beeinflusst. Ein Ziel aktueller Forschung ist es deshalb, Nanokomposite definierter Gestalt und Porosität zu konstruieren. Bei der Herstellung von Materialien, die für solche Anwendungen in Frage kommen, ist es also entscheidend, dass die gewünschte Struktur und die damit verbundenen Eigenschaften durch gezielte Synthese auf das Endprodukt übertragen werden können. Ein neuer Trend bei ihrer Herstellung ist der Einsatz von Templaten, z.B. organischen Verbindungen, die gezielt auf die Struktur dieser Materialien Einfluss nehmen. Eine Optimierung der Synthesebedingungen kann erreicht werden, indem man zu einer schrittweisen Synthese übergeht. Ausgangspunkt dieser step by step Synthese ist eine flüssigkristalline Tensidphase. Der anorganische Prekursor wird in dieser voraggregierten Phase gelöst ohne sie dabei zu verändern. Damit entsteht die hochgeordnete Struktur nicht erst in einem nicht kontrollierbaren Zusammenspiel von Prekursor und Templat, sondern kann systematisch eingestellt werden. Die Ordnung der voraggregierten Templatphase kann durch eine gezielte Temperaturänderung oder das Anlegen äußerer Felder (Magnetfelder) erhöht werden.
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Totalsynthese von Yahazunol und Untersuchungen zur Synthese von Siphonodictyal C
(2004)
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Thorsten Laube
- Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese der beiden 12-Nordrimane (+)-11-Hydroxy-12-nordrim-9,11-en-8-on und (+)-(8S)-12-Nordriman-8,11-diacetat, dem Sesquiterpenaren Yahazunol sowie Untersuchungen zur Synthese von Siphonodictyal C. Die zentrale Ausgangsverbindung für die Synthese dieser marinen Naturstoffe ist (±)-8-Oxo-12-nordriman-11-säuremethylester, der über eine dreistufige Synthese ausgehend von beta-Ionon erhalten werden kann. Mit Hilfe von (2R,3R)-2,3-Butandiol bzw. (2S,3S)-1,4-Di-O-benzylthreitol ist man in der Lage, die Enantiomeren von (±)-8-Oxo-12-nordriman-11-säuremethylester in Diastereomere zu überführen und diese nach Reduktion bzw. Debenzylierung chromatographisch zu trennen. Nach Abspaltung der Schutzgruppen erhält man (+)- bzw. (–)-11-Hydroxy-12-nordriman-8-on bzw. (+)- bzw. (–)-8-Oxo-12-nordriman-11-säuremethylester. Ausgehend von diesen Produkten konnten die beiden 12-Nordrimane (+)-11-Hydroxy-12-nordrim-9,11-en-8-on und (+)-(8S)-12-Nordriman-8,11-diacetat erstmals enantiomerenrein synthetisiert werden. Siphonodictyal C enthält eine Doppelbindung in Pos. 7,8 des Drimanteils. Diese kann durch Umlagerung der 8,12-Doppelbindung erhalten werden. Durch Reduktion von (±)-Albicansäuremethylester, der durch eine Wittig-Reaktion aus (±)-8-Oxo-12-nordriman-11-säuremethylester erhältlich ist, mit Hilfe von DIBAl-H erhält man (±)-Albicanol, das in Gegenwart der Lewis-Säure BF3*Et2O durch eine 1,3-Hydridverschiebung (±)-Drimenol ergibt. Durch Oxidation mit PCC erhält man schließlich (±)-Drimenal. Der zweite Baustein von Siphonodictyal C lässt sich ausgehend von Sesamol synthetisieren. Die freie OH-Gruppe von Sesamol wird mit MEM geschützt und Bromierung liefert schließlich 6-Bromsesamol-MEM-ether. Durch einen Br-Li-Austausch mit n-BuLi bei –100o C erhält man den lithiierten Aromaten, der mit (±)-Drimenal zu den diastereomeren Benzylalkoholen umgesetzt wird. Durch Behandlung mit PTS bei 40o C kommt es zur benzylischen Dehydratisierung und das Alkylidencyclohexadienon wird gebildet. Dieses lässt sich durch Reduktion mit NaBH4 zum entsprechenden Phenol reduzieren, welches anschließend mit DMS methyliert wird. Der nächste Schritt war die Umsetzung mit n-BuLi/DMF, um die Formylgruppe in Pos. 3´ des Aromaten einzuführen. Die abschließende Abspaltung der Schutzgruppen führte nicht zum Erfolg. Auch die Verwendung anderer Schutzgruppen verlief ergebnislos, da hierbei große Probleme bei der Kupplung, der Formylierung und der Schutzgruppenentfernung auftraten. Deshalb wurde die Synthese von Siphonodictyal C auf dieser Stufe beendet. Behandelt man (+)-11-Hydroxy-12-nordriman-8-on mit PTS bei 50o C, so erhält man das alpha,beta-ungesättigte Keton. Dieses ist nun in der Lage mit einem Cuprat in einer 1,4-Michael-Addition zu reagieren. Das benötigte Cuprat erhält man aus dem Grignardreagenz 2,5-Dibenzyloxyphenylmagnesium-bromid und CuI. Das bei der Reaktion entstehende Enol lässt sich durch Zugabe von Acetylchlorid als Enolacetat abfangen. Durch alkalische Verseifung erhält man das 12-Norsesquiterpenaren und durch anschließende Wittig-Reaktion (+)-Zonarol-dibenzylether. Die in Yahazunol enthaltene äquatoriale Hydroxygruppe in Pos. 8 lässt sich durch Epoxidierung der exo-cyclischen Doppelbindung von (+)-Zonaroldibenzylether und anschließende reduktive Öffnung des Epoxids mit LiAlH4 einführen. Der letzte Schritt in der Synthese war die Abspaltung der beiden Benzylschutzgruppen. Dies geschah hydrogenolytisch mit Palladium als Katalysator. Yahazunol konnte mit einer Ausbeute von 61 % erhalten werden. Die spektroskopischen Daten und der Drehwert der synthetisierten Verbindung stimmten mit denen der isolierten Verbindung gut überein.
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Neue Materialien für optoelektronische und elektronische Bauteile
(2004)
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Klaus Kreger
- Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Synthese von organischen Verbindungen auf der Basis von Fluorenen und Carbazolen, welche als aktives Material in Halbleiterbauteilen, wie organische Leuchtdioden (OLED) oder organische Transistoren (OFET) eingesetzt wurden. Molekular einheitliche, niedermolekulare Verbindungen können in hochreiner Form erhalten werden. Sie besitzen keine Endgruppen und zeigen keine Verteilung von physikalischen Eigenschaften. Die Verbindungen sollen eine stabile nichtkristalline Morphologie besitzen. Verbindungen mit sternförmiger Architektur neigen häufig zur Glasbildung. Unter solchen so genannten organischen Gläsern versteht man niedermolekulare Verbindungen, die in der Lage sind eine stabile amorphe Phase auszubilden. Solche trigonalen sternförmigen Verbindungen bestehen aus einem starren konjugierten Kern und einer entsprechenden Anzahl an Flügelgruppen. Als Flügelgruppen kamen verschiedene 9-alkylierte Fluoren- und Carbazolbausteine zum Einsatz. Als Kerne wurden Triphenylamin, Triphenylbenzol, Benzol, Tristhienylbenzol und Triphenylen verwendet. Der Schlüsselschritt der Synthese ist eine Suzukireaktion. Die meisten Verbindungen bilden amorphe Phasen, wobei die Glasübergangstemperaturen zwischen 57-158°C variieren. Die amorphe Phase ist dabei ausgesprochen lagerstabil. Die energetischen Lücken liegen zwischen 3,0-3,5 eV. Solche Verbindungen zeigen eine intensiv blaue bis violettblaue Fluoreszenz. Die HOMO-Niveaus variieren zwischen -5 eV und -6 eV. Aminderivate eignen sich als Lochleiter sowie als blaue Emitter. Verbindungen mit tiefliegenden HOMO-Niveaus und großen energetischen Lücken können als Lochblocker fungieren. Daneben wurden konjugierte organische Materialien synthetisiert, die eine hochgeordnete Phase aufweisen. Hierfür kamen Flüssigkristalle in Frage. Neben der Synthese von Flüssigkristallen, deren Phase durch Unterkühlung eingefroren werden kann, wurden auch so genannte Reaktivmesogene hergestellt. In diesem Fall wird die momentane morphologische Ordnung mittels einer photochemischen Reaktion permanent in einem Netzwerk fixiert. Des Weiteren galt darauf zu achten, dass die Materialien bevorzugt Löcher leiten. Stäbchenförmige Verbindungen, wie z.B. ein 2,7-Bis(carbazol-2-yl)-fluoren zeigen bereits ein flüssigkristallines Verhalten. Der Zugang zu solchen Verbindungen wurde via Suzukireaktion realisiert. Eine Methoxygruppe in der 7-Position des Carbazols ermöglichte nach einer Etherspaltung den weiteren Aufbau zum Reaktivmesogen. Mit gezielten repetiven Suzukireaktionen war auch der Zugang zu linearen 2,7-verknüpften Pentameren mit unterschiedlichen Abfolgen von Fluoren- und Carbazolbausteinen möglich. Solche Verbindungen können dabei eine flüssigkristalline Phasenbreite von mehr als 250°C besitzen. Schließlich wurden N-Arylierte Tercarbazole hergestellt. Solche Tercarbazole sind thermisch extrem stabil und besitzen stabile amorphe Phasen mit Glasübergangstemperaturen bei 103°C bzw. 190°C. Deren HOMO-Niveaus berechnen sich zu –5.2 eV, was etwas tiefer als ein entsprechendes N-alkyliertes 3,6-verknüpftes Tercarbazol ist. Die N-Arylgruppe ist offensichtlich nicht an der Konjugation beteiligt. Mehrschicht-OLEDs wurden mittels Aufdampfprozesse hergestellt. Dabei fungierte ein sternförmiges Triphenylbenzolderivat als Lochblocker. Ein sternförmiges Aminderivat wurde als Lochleiter und als Emitter eingesetzt. Das effizienteste Device wurde durch Aufdampfen von Stufengradienten ermittelt. Eine 5 nm dicke Lochblockerschicht ist ausreichend, um den Löcherstrom an der Grenzfläche zu stoppen. Die spannungsunabhängige Emission mit den CIE-Koordinaten x = 0.154 und y = 0.146 stammt ausschließlich vom Lochleiter. Die Leuchtdichten betragen ~400 cd/m2 bei 10V. Die max. Effizienzen liegen bei ~2 cd/A und die Lichtausbeuten bei ~0,8 lm/W. Eine Reihe der Materialien wurden bei Philips (Eindhoven) und Merck (Southhampton) auf ihre Transistoraktivität untersucht. Von der Mehrzahl der Verbindungen konnten dabei homogene Filme aus Lösung erhalten werden. Dabei hat sich gezeigt, dass das Einsetzen eines Stromes wesentlich von einem ohmschen Kontakts mit der Gold-Elektrode abhängig ist. Ebenso erhöhen unzureichende Filmbildungseigenschaften die Onset-Spannung und führen zu niedrigen Drainströmen. Beides kann durch das Verwenden von Carbazolbausteinen anstelle des Fluorens und mit der Wahl von geeigneten Alkylketten vermieden werden. Die Orientierbarkeit und die Strukturierbarkeit von Reaktivmesogenen wurde demonstriert. Allerdings sinkt dabei die Beweglichkeit nach der Vernetzung deutlich. Insbesondere sternförmige Verbindungen auf der Basis von Triphenylaminen zeigen ein Einsetzen des Stromes nahe bei 0V. Solche amorphe Filme besitzen eine Beweglichkeit von mehr als 10-4 cm2/Vs in nichtoptimierten Devices. Die On/Off-Verhältnisse betragen 104-105. Als wesentliche Vorzüge solcher aromatischen Amine sind die geringen Hystereseffekte und die exzellente Lagerstabililtät an Luft zu nennen.
