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- Dreidimensionale NMR-Spektroskopie (2)
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Molekulare Grundlagen der Erdnussallergie: Rekombinante Darstellung, biochemische und biophysikalische Charakterisierung und Struktur der Erdnussallergene Ara h 2 und Ara h 6
(2003)
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Katrin Lehmann
- Die Erdnussallergie stellt auf Grund ihrer Verbreitung und der Stärke der ausgelösten Reaktionen ein ernsthaftes Gesundheitsproblem dar. Der derzeit einzige Schutz vor den typischen Symptomen besteht in einem absoluten Verzicht auf erdnusshaltige Lebensmittel. Folglich stellt die Charakterisierung von Erdnussallergenen eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung von diagnostischen und therapeutischen Ansätzen dar. Als Grundlage für biochemische und biophysikalische Studien wurde eine rekombinante Expressionsstrategie zur Herstellung von authentisch gefaltetem Ara h 2 und Ara h 6 in dieser Arbeit entwickelt. Die Strategie zur effizienten Präparation großer Mengen Protein basiert auf der Anwendung spezieller E. coli Stämme mit oxidativem Cytoplasma und eignet sich zur Expression nativ gefalteter und disulfidverbrückter rekombinanter Erdnussallergene vom 2S Albumintyp und mit hoher Wahrscheinlichkeit weiterer Mitglieder dieser Proteinfamilie. Die Integrität der Sekundär- und Tertiärstruktur, der Disulfidverbrückung und der immunologischen Reaktivität der rekombinanten Proteine wurde am Beispiel von Ara h 2 mit Hilfe von natürlichem Protein aus der Erdnuss verifiziert. Die Verfügbarkeit von authentischen rekombinanten Erdnussallergenen eröffnet neue Möglichkeiten für eine verfeinerte Diagnose allergischer Erkrankungen und für die Entwicklung von spezifischen Immuntherapien. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass sich die Allergene Ara h 2 und Ara h 6 durch eine außerordentliche Stabilität gegenüber thermaler Denaturierung und proteolytischem Abbau auszeichnen. Durch CD spektroskopische Studien wurde eine Disulfidbrücken abhängige Stabilität der Sekundärstruktur bis 373 K nachgewiesen. Die Resistenz gegenüber Verdauungsreaktionen wurde an Hand der Enzyme Trypsin und Chymotrypsin untersucht. Der proteolytische Verdau von Ara h 2 und Ara h 6 resultierte in der Ausbildung heterodimerer immunologisch aktiver Produkte. Der proteolytische Angriff erfolgt innerhalb zweier definierter Bereiche. Die resistenten Kernbereiche der Proteine beinhalten eine Reihe von vor Proteolyse geschützten Schnittstellen. Die Faltungen der unverdauten Proteine und der proteaseresistenten Kernbereiche sind nahezu identisch. Die proteaselabilen Bereiche weisen keine reguläre Sekundärstruktur auf und sind von einer signifikanten Flexibilität geprägt. Die für die Erdnussallergene Ara h 2 und Ara h 6 nachgewiesene Stabilität stellt ein wichtiges Merkmal der Lebensmittelallergene dar. Je länger ein möglichst großer Proteinabschnitt intakt bleibt, umso höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Immunantwort ausgelöst werden kann und umso stärker wird diese ausfallen. In der vorliegenden Arbeit konnte die Lösungsstruktur des proteaseresistenten Ara h 6-Kerns bestimmt und charakterisiert werden. Die resultierende Struktur besteht aus fünf alpha-Helices, die einen vor enzymatischer Spaltung geschützten kompakten Kernbereich ausbilden. Die ermittelte Struktur stellt die erste experimentell bestimmte dreidimensionale Struktur eines Erdnussallergens und die erste hochaufgelöste Struktur eines 2S Albumins dar. Die globale Faltung von Ara h 6 aus der Erdnuss ähnelt weiteren Pflanzenproteinen: den nichtspezifischen Lipidtransferproteinen, den Amylase/Trypsin-Inhibitoren und dem hydrophoben Protein aus Sojabohne. Eine wichtige Frage betrifft die Lokalisation der IgE bindenden Epitope. In früheren Studien konnten in Ara h 6 keine linearen IgE reaktiven Epitope identifiziert werden, für Ara h 2 wurden hingegen drei immunodominante Regionen beschrieben. Um die Frage nach der Lokalisation dieser Epitope innerhalb der dreidimensionalen Struktur von Ara h 2 zu klären, wurde ein molekulares Modell des Proteins auf der Basis der experimentell gelösten Ara h 6 Struktur erstellt. Sämtliche Epitope befinden sich in einem ausgedehnten Schleifenbereich und am aminoterminalen Ende des Proteins. Dieser Befund weist in Kombination mit der Kenntnis, dass die Multivalenz eines Allergens eine Voraussetzung für das Auslösen einer allergischen Antwort darstellt und mit ihrer Intensität korreliert, stark auf die Existenz von konformationellen Epitopen in Ara h 6 und Ara h 2 hin. Die Präsentation von stabilen konformationellen Epitopen auf Mastzellen führt im Allgemeinen zu einer effizienteren und stärkeren Mediatorausschüttung. Dies ist mit den beobachteten starken klinischen Symptomen bei Patienten mit Erdnussallergie konsistent. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Stabilität und Kompaktheit der Struktur sowie das potentielle Vorhandensein von konformationellen Epitopen eine Erklärung für die extreme Allergenizität der Erdnussallergene liefern kann. Die Identifizierung von IgE-bindenden Epitopen auf der Basis der dreidimensionalen Struktur der Erdnussallergene liefert eine Grundlage für die Entwicklung von veränderten Proteinen mit reduzierter Allergenizität, dem Verständnis von Kreuzallergien und der Entwicklung neuer Therapieformen.
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Strukturbestimmung des humanen Guanylin-Prohormons zur Analyse der Rolle einer Hormon-Prosequenz und Design eines löslichen Fragments der extrazellulären Domäne der Guanylatzyklase-C
(2003)
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Thomas Lauber
- Die Peptidhormone Guanylin und Uroguanylin sind als spezifische Liganden der intestinalen membrangebundenen Guanylatzyklase-C (GC-C) entscheidend an der Regulation des Flüssigkeits- und Elektrolythaushalts im Darm beteiligt. Obwohl die Rolle dieses Guanylin/GC-C Systems bei der durch die hitzestabilen bakteriellen Enterotoxine vermittelten Diarrhöe schon lange bekannt ist, kennt man bis heute keine strukturellen Details der Vorläuferproteine der GC-C-Liganden, der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne der GC-C (GC-CECD) und der Liganden/Rezeptor-Wechselwirkung. Um zum Verständnis der biochemischen Eigenschaften des Guanylin-Prohormons beizutragen sowie den Einfluß der Prosequenz auf die Ausbildung der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Disulfidbrücken zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Struktur von humanem Proguanylin bestimmt. Weiterhin wurde als Grundlage für weiterführende NMR-spektroskopische Untersuchungen der Guanylin/GC-C-Wechselwirkung ein geeignetes Fragment der GC-CECD konstruiert. Um die Strukturbestimmung von Proguanylin zu ermöglichen, wurde zunächst ein effizientes Expressions- und Reinigungsprotokoll entwickelt, das es erlaubte, Proguanylin mit der nativen Disulfidverbrückung und natürlichen biologischen Aktivität in löslicher Form zu gewinnen. Durch den Vergleich mit dem natürlichen, aus menschlichem Hämofiltrat isolierten Prohormon wurden für beide Proteine übereinstimmende biophysikalische Eigenschaften und dreidimensionale Strukturen nachgewiesen. Des Weiteren wurde mittels analytischer Sedimentationsexperimente für beide Proteine eindeutig ein monomerer Assoziationsgrad in Lösung auch bei millimolaren Konzentrationen nachgewiesen und dadurch ein früher postulierter dimerer Zustand widerlegt. Die anschließende Berechnung der dreidimensionalen Struktur von Proguanylin erfolgte durch die Verwendung von 700 aus den NMR Spektren des homogen 15N und 13C/15N markierten rekombinanten sowie des natürlichen Proteins abgeleiteten experimentellen Randbedingungen. Die Struktur von Proguanylin in Lösung stellt einen neuen Proteinfaltungstyp dar und weist drei zu einem Bündel zusammengelagerte alpha-Helices, ein kurzes, dreisträngiges, antiparalleles beta-Faltblatt sowie einen 23 Aminosäuren umfassenden unstrukturierten Bereich auf. Da das Faltblatt durch zwei N-terminale und einen C-terminalen Strang gebildet wird, kommt es zu einer unmittelbaren Nachbarschaft der Termini. Dabei wird die Hormonregion (Reste 80-94) von Proguanylin unter anderem durch die Wechselwirkungen mit dem N-terminalen Faltblattstrang in einer Guanylin A-Isomer ähnlichen Topologie stabilisiert. Diese Kontakte bewirken außerdem eine teilweise Abschirmung der ansonsten im freien Hormon zugänglichen Oberfläche und können daher die äußerst geringe Affinität bezüglich der GC-C und die damit verbundene vernachlässigbare Aktivität von Proguanylin erklären. Eine beobachtete Wechselwirkung zwischen der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Seitenkette von Tyr88 mit Arg72 leistet einen zusätzlichen Beitrag zur Inaktivierung der Hormonregion. Die Wechselwirkungen zwischen den terminalen Bereichen in der Proguanylin-Struktur scheinen außerdem für die Ausbildung der nativen Disulfidverbrückung essentiell zu sein. Eine Bestätigung dieser Annahmen wurde aus der Analyse von Proguanylin-Mutanten erhalten, die eine strukturstabilisierende Funktion der Disulfidbrücke C48-C61 nahelegt und für einen direkten Einfluß der Prosequenz auf die Struktur der Hormonregion spricht. Basierend auf einer weiteren Mutante konnte außerdem für das homologe Uroguanylin-Prohormon ein Strukturmodell erstellt werden. Für die GC-CECD wurde ein Strukturmodell erstellt, mit dessen Hilfe die Ligandenbindungsregion auf die direkte Umgebung eines exponierten und zugänglichen Faltblattstrangs kartiert werden konnte. Daher wurde für die Wechselwirkung zwischen Guanylin und der GC-CECD ein zu den intramolekularen Kontakten zwischen Guanylin und der Prosequenz ähnliches Interaktionsmotiv postuliert. Aufgrund der Größe und des Oligomerzustandes ist die GC-CECD nicht für NMR-spektroskopische Untersuchungen zur detaillierten Charakterisierung der Wechselwirkung dieses Rezeptors mit seinen Liganden geeignet. Daher wurde ein kleineres, lösliches, strukturiertes und zur Ligandenbindung fähiges Rezeptorfragment benötigt, das in Form der als miniGC-C bezeichneten membrannahen Subdomäne der GC-CECD konstruiert wurde. Dieses Fragment erfüllt die gewünschten Anforderungen und ist zur hoch affinen Bindung des Liganden STp-(5-17) in der Lage. Zur Untersuchung des zugehörigen Komplexes stellt das entwickelte Expressions- und Reinigungssystem zur Gewinnung von rekombinantem Proguanylin gleichzeitig die Grundlage für die Herstellung von homogen 15N und 13C/15N markiertem Guanylin dar, welches für zukünftige NMR-spektroskopische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Guanylin und der GC-C benötigt wird.
