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Strukturbestimmung von Birkenpollenallergenen und birkenpollenassoziierten Nahrungsmittelallergenen mit NMR-Spektroskopie
(2003)
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Philipp Neudecker
- Das 17,4kDa schwere Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 ist bei mehr als 90% der Birkenpollenallergiker für die Bindung der IgE-Antikörper verantwortlich, und IgE-Kreuzreaktionen mit verwandten Proteinen wie Pru av 1 (früher Pru a 1) aus Kirschen, Gly m 4 (ursprünglich SAM22) aus Sojabohnen und Api g 1 aus Sellerie verursachen bei bis zu 70% dieser Patienten allergische Reaktionen auf Nüsse, Obst oder Gemüse. Die molekulare Grundlage für die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Pru av 1 stellt die fast vollständige Identität ihrer Tertiärstrukturen dar. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten NMR-spektroskopischen Untersuchungen erbrachten den experimentellen Nachweis, dass der ungewöhnlich große hydrophobe Hohlraum im Innern von Pru av 1 mit Steroiden wechselwirkt. Modellierungen zeigten, dass der Hohlraum groß genug für zwei Steroidmoleküle ist, und erlaubten die Vorhersage der Komplexstruktur. Die Konformation des Proteinrückgrats von Pru av 1 wt ist in der hochaufgelösten dreidimensionalen Struktur der weniger IgE-reaktiven Mutante Pru av 1 E45W in Lösung konserviert, was zeigt, dass die Seitenkette von Glu45 an einem kreuzreaktiven IgE-Epitop beteiligt ist. Dementsprechend wurde die IgE-Bindung an Api g 1.0101 durch die Mutation K44E erhöht. Der fast vollständige Verlust der IgE-Bindung an Pru av 1 S112P ist die Folge einer Zerstörung der Tertiärstruktur. Weder die Mutation S112A noch die Deletion der COOH-terminalen Reste 155-159 beeinflusste die IgE-Bindung an Pru av 1. Die P-Schleife um Glu45 erklärt somit teilweise das klinisch beobachtete IgE-Kreuzreaktionsmuster und ortsgerichtete Mutagenese von Glu45 stellt einen Ansatz zur Entwicklung hypoallergener Varianten für die spezifische Immuntherapie dar. Als Ausgangspunkt zur Schließung der strukturellen Lücke zwischen der konstitutiv exprimierten Bet v 1-Familie von Allergenen und der verwandten stressinduzierten PR-10-Familie von mit Krankheitsbefall zusammenhängenden Proteinen wurde der Großteil der 1H-, 13C- und 15N-Resonanzen des stressinduzierten PR-10-Proteins Gly m 4 zugeordnet und eine Reihe von NOESY-Spektren aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen, skalaren und dipolaren Kopplungskonstanten bestätigen ein auf der Grundlage von Pru av 1 und Bet v 1 erstelltes Homologiemodell, so dass die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Gly m 4 ebenfalls auf einer praktisch identischen Tertiärstruktur beruht. Zwischen 5% und 20% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 9,4kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 4, ein Ca2+-bindendes Polcalcin. Wegen der hohen IgE-Kreuzreaktivität der Polcalcine sind viele Patienten auf Pollen verschiedenster Pflanzen polysensibilisiert. Die mit mehrdimensionaler heteronuklearer NMR-Spektroskopie bestimmte hochaufgelöste dreidimensionale Struktur von holo Bet v 4 zeigt ein kanonisches EF-Hand-Paar in der offenen Konformation. Die hochkonservierte polcalcinspezifische amphipatische COOH-terminale a-Helix deckt lediglich einen Teil der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche von holo Bet v 4 ab. Anders als das Polcalcin Phl p 7 aus dem Wiesenlischgras, für das vor kurzem eine durch Domain Swapping entstandene dimere Struktur nachgewiesen wurde, zeigen die hydrodynamischen Parameter aus NMR-Relaxation, NMR-Translationsdiffusion und analytischer Ultrazentrifugation, dass sowohl apo als auch holo Bet v 4 vorwiegend monomer sind. Die geringere Dispersion der chemischen Verschiebungen und der etwas größere hydrodynamische Radius von apo Bet v 4 weisen auf eine reversible Änderung der Struktur bei Ca2+-Bindung hin, was die geringere IgE-Bindungsfähigkeit von apo Bet v 4 erklärt. Trotz ihrer unterschiedlichen Oligomerisierungszustände sind die Tertiärstrukturen von holo Bet v 4 und holo Phl p 7 bemerkenswert ähnlich, was eine zwanglose Erklärung für die IgE-Kreuzreaktivität liefert. Zusammen mit der engen strukturellen Homologie zu Calmodulin und der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche weist diese Änderung der Struktur eher auf eine regulatorische denn eine Ca2+-Speicherfunktion für Bet v 4 hin. Etwa 12% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 34,2kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 6 (früher Bet v 5), das hochgradig IgE-kreuzreaktiv mit Pyr c 5 aus Birnen ist. Die Tertiärstruktur dieser Phenylcoumarin-Benzylether-Reduktasen ist noch unbekannt. Die homonuklearen NMR-Spektren von Pyr c 5 zeigen eine ausgezeichnete Dispersion der chemischen Verschiebungen, was auf eine gemischte a/b-Sekundärstruktur hindeutet. Der Ausschluss vernachlässigbarer Terme durch Einführung eines geeigneten Grenzwerts sparte einen erheblichen Teil der durch die Verwendung des gaußförmigen Datenbank-Potentials verursachten Zunahme des Rechenzeitbedarfs der Strukturberechnung dieser Allergene ein, ohne die Qualität der resultierenden Strukturen zu beeinträchtigen. Außerdem wurden mehrere Inkonsistenzen in der Standardparametrisierung der kovalenten Geometrie des Kraftfelds beseitigt.
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Molekulare Grundlagen der Erdnussallergie: Rekombinante Darstellung, biochemische und biophysikalische Charakterisierung und Struktur der Erdnussallergene Ara h 2 und Ara h 6
(2003)
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Katrin Lehmann
- Die Erdnussallergie stellt auf Grund ihrer Verbreitung und der Stärke der ausgelösten Reaktionen ein ernsthaftes Gesundheitsproblem dar. Der derzeit einzige Schutz vor den typischen Symptomen besteht in einem absoluten Verzicht auf erdnusshaltige Lebensmittel. Folglich stellt die Charakterisierung von Erdnussallergenen eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung von diagnostischen und therapeutischen Ansätzen dar. Als Grundlage für biochemische und biophysikalische Studien wurde eine rekombinante Expressionsstrategie zur Herstellung von authentisch gefaltetem Ara h 2 und Ara h 6 in dieser Arbeit entwickelt. Die Strategie zur effizienten Präparation großer Mengen Protein basiert auf der Anwendung spezieller E. coli Stämme mit oxidativem Cytoplasma und eignet sich zur Expression nativ gefalteter und disulfidverbrückter rekombinanter Erdnussallergene vom 2S Albumintyp und mit hoher Wahrscheinlichkeit weiterer Mitglieder dieser Proteinfamilie. Die Integrität der Sekundär- und Tertiärstruktur, der Disulfidverbrückung und der immunologischen Reaktivität der rekombinanten Proteine wurde am Beispiel von Ara h 2 mit Hilfe von natürlichem Protein aus der Erdnuss verifiziert. Die Verfügbarkeit von authentischen rekombinanten Erdnussallergenen eröffnet neue Möglichkeiten für eine verfeinerte Diagnose allergischer Erkrankungen und für die Entwicklung von spezifischen Immuntherapien. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass sich die Allergene Ara h 2 und Ara h 6 durch eine außerordentliche Stabilität gegenüber thermaler Denaturierung und proteolytischem Abbau auszeichnen. Durch CD spektroskopische Studien wurde eine Disulfidbrücken abhängige Stabilität der Sekundärstruktur bis 373 K nachgewiesen. Die Resistenz gegenüber Verdauungsreaktionen wurde an Hand der Enzyme Trypsin und Chymotrypsin untersucht. Der proteolytische Verdau von Ara h 2 und Ara h 6 resultierte in der Ausbildung heterodimerer immunologisch aktiver Produkte. Der proteolytische Angriff erfolgt innerhalb zweier definierter Bereiche. Die resistenten Kernbereiche der Proteine beinhalten eine Reihe von vor Proteolyse geschützten Schnittstellen. Die Faltungen der unverdauten Proteine und der proteaseresistenten Kernbereiche sind nahezu identisch. Die proteaselabilen Bereiche weisen keine reguläre Sekundärstruktur auf und sind von einer signifikanten Flexibilität geprägt. Die für die Erdnussallergene Ara h 2 und Ara h 6 nachgewiesene Stabilität stellt ein wichtiges Merkmal der Lebensmittelallergene dar. Je länger ein möglichst großer Proteinabschnitt intakt bleibt, umso höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Immunantwort ausgelöst werden kann und umso stärker wird diese ausfallen. In der vorliegenden Arbeit konnte die Lösungsstruktur des proteaseresistenten Ara h 6-Kerns bestimmt und charakterisiert werden. Die resultierende Struktur besteht aus fünf alpha-Helices, die einen vor enzymatischer Spaltung geschützten kompakten Kernbereich ausbilden. Die ermittelte Struktur stellt die erste experimentell bestimmte dreidimensionale Struktur eines Erdnussallergens und die erste hochaufgelöste Struktur eines 2S Albumins dar. Die globale Faltung von Ara h 6 aus der Erdnuss ähnelt weiteren Pflanzenproteinen: den nichtspezifischen Lipidtransferproteinen, den Amylase/Trypsin-Inhibitoren und dem hydrophoben Protein aus Sojabohne. Eine wichtige Frage betrifft die Lokalisation der IgE bindenden Epitope. In früheren Studien konnten in Ara h 6 keine linearen IgE reaktiven Epitope identifiziert werden, für Ara h 2 wurden hingegen drei immunodominante Regionen beschrieben. Um die Frage nach der Lokalisation dieser Epitope innerhalb der dreidimensionalen Struktur von Ara h 2 zu klären, wurde ein molekulares Modell des Proteins auf der Basis der experimentell gelösten Ara h 6 Struktur erstellt. Sämtliche Epitope befinden sich in einem ausgedehnten Schleifenbereich und am aminoterminalen Ende des Proteins. Dieser Befund weist in Kombination mit der Kenntnis, dass die Multivalenz eines Allergens eine Voraussetzung für das Auslösen einer allergischen Antwort darstellt und mit ihrer Intensität korreliert, stark auf die Existenz von konformationellen Epitopen in Ara h 6 und Ara h 2 hin. Die Präsentation von stabilen konformationellen Epitopen auf Mastzellen führt im Allgemeinen zu einer effizienteren und stärkeren Mediatorausschüttung. Dies ist mit den beobachteten starken klinischen Symptomen bei Patienten mit Erdnussallergie konsistent. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Stabilität und Kompaktheit der Struktur sowie das potentielle Vorhandensein von konformationellen Epitopen eine Erklärung für die extreme Allergenizität der Erdnussallergene liefern kann. Die Identifizierung von IgE-bindenden Epitopen auf der Basis der dreidimensionalen Struktur der Erdnussallergene liefert eine Grundlage für die Entwicklung von veränderten Proteinen mit reduzierter Allergenizität, dem Verständnis von Kreuzallergien und der Entwicklung neuer Therapieformen.
