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Jahresbericht 2010 - Universität Bayreuth Rechenzentrum
(2011)
- Jahresbericht
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Etablierung von Methoden zur Bioevaluation antitumoraler Naturstoffe, Metabolite und Analoga
(2011)
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Sebastian Knauer
- Die Ziele, die ich mir vor Beginn meiner Arbeit gesteckt habe (siehe 1.3), wurden weitestgehend erreicht. Es wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe Illudin M 11 zuverlässig gewonnen werden kann. Die Aufzucht von O. olearius im Medium HA- und die Extraktion nach Kutscher-Steudel erwiesen sich hierbei als Methoden der Wahl. Illudin S 11a konnte jedoch nicht isoliert werden.
Daneben konnte eine Reihe von Verfahren zur Evaluierung von Testsubstanzen etabliert werden. Die Untersuchungen der Substanzeigenschaften (siehe 2.5 bis 2.8) lieferten nützliche und verlässliche Ergebnisse, auch wenn man hinsichtlich des Einsatzbereiches manchmal Einschränkungen in Kauf nehmen musste. Die Stabilität von Esterbindungen wurde auf zwei Arten untersucht. Die getesteten Substanzen 16c, 18 und 19b erwiesen sich hierbei als weitestgehend stabil gegenüber Hydrolyse (siehe 3.2). Die Methode, die zur Untersuchung der Komplexbildung eingesetzt wurde, lässt sich nicht auf alle Verbindungen übertragen, sondern nur auf solche, deren Komplexe ein Absorptionsmaximum im sichtbaren Bereich besitzen (siehe 3.3). Bei den Eisenkomplexen war das Potential der getesteten Liganden, Komplexe zu bilden vergleichbar mit dem von EDTA. Bei den anderen getesteten Kationen war dieses schwächer ausgeprägt. Im Rahmen des Glutathion-Monitorings wurde festgestellt, dass – im Gegensatz zur Muttersubstanz 11 – keines der getesteten Illudinderivate 27 eine spontane Reaktion mit GSH eingeht (siehe 3.4). Der Alkylierungsassay mit Aceton liefert nur für farblose Verbindungen verlässliche Ergebnisse. Bei den getesteten Illudinderivaten 27 konnte zwar ein Alkylierungspotential gemessen werden, doch stellt deren vorhandene Eigenabsorption einen gewissen Unsicherheitsfaktor dar. Der Alkylierungsassay mit Acetophenon lieferte keine verwertbaren Ergebnisse (siehe 3.5).
Die zellbasierten Analysen (siehe 2.9 bis 2.11) sowie der CAM-Assay (siehe 2.12) sind für alle Stoffe durchführbar. Auch wenn die untersuchten Organismen (Zellen und Embryonen) nicht immer auf die gleiche Weise reagieren, kommen auch hierbei verlässliche Resultate zu Stande. Da die Zahl der durchführbaren Tests durch Kosten und Verfügbarkeit der Untersuchungsobjekte limitiert ist, wurde hinsichtlich der Testsubstanzen immer eine Vorauswahl getroffen. Beim TUNEL-Test zeigten die meisten Verbindungen ein proapoptotisches Verhalten, besonders gut wirkten die Illudinderivate 27 (siehe 3.6). Der Annexin-Test ist nur bedingt aussagekräftig. Er ließ sich zum einen nur mit Suspensionszellen durchführen, zum anderen war es manchmal kaum möglich, spätapoptotische von nekrotischen Zellen zu unterscheiden (siehe 3.7). Mit Hilfe von Immunoblots wollte man Rückschlüsse hinsichtlich des Mechanismus der Apoptoseinitiierung ziehen. Die schnelle Prozessierung der Caspase 9 legt den Schluß nahe, dass die Platinkomplexkonjugate 13 (HL 60), die Oxazole 26 (Kb-V1), die Illudinderivate 27 (HL 60 und 518 A2) und die Chalkone 20, 21a und 21c (HL 60) zu einer Aktivierung über den mitochondrialen Weg führen. Die anderen Testverbindungen bedürfen weiterer Untersuchungen in Bezug auf den Signalweg der Apoptoseinitiierung (siehe 3.8). Einige Derivate der antivaskulären Verbindung Combretastatin A-4 7a wurden mit Hilfe des CAM-Assays untersucht. Die meisten zeigten hierbei erwartungsgemäß ein vergleichbares Verhalten. Besonders interessant ist der Aktivitätsunterschied der Combretastatin-Analoga 26h und 26i. Dieser wurde sowohl beim TUNEL-Test als auch beim CAM-Assay beobachtet, obwohl sich beide Verbindungen strukturell kaum unterscheiden.
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Regulation der Aktivität des Anti-Sigmafaktors RsiX aus Bacillus subtilis
(2011)
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Katharina Schäfer
- Der Gram-positive Modellorganismus Bacillus subtilis besitzt 17 alternative Sigmafaktoren, von denen 7 zur Gruppe der ECF (extra-cytoplasmic function) -Sigmafaktoren gehören. Einer dieser ECF-Sigmafaktoren, SigX, und sein entsprechender Anti-Sigmafaktor, RsiX, sind Gegenstand dieser Arbeit. Dabei handelt es sich bei RsiX um ein Transmembranprotein, während SigX im Cytoplasma lokalisiert ist und von der N-terminalen RsiX-Domäne von einer Interaktion mit der RNA-Polymerase abgehalten wird. SigW, ein weiterer ECF-Sigmafaktor, und RsiW, der dazugehörende Anti-Sigmafaktor, sind bereits sehr gut untersucht. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten zwischen SigX/RsiX und SigW/RsiW wurde angenommen, dass die Aktivierung des SigX-Regulons in vergleichbarer Weise erfolgt, wie es für das SigW-Regulon aufgrund intensiver Analysen sehr gut untersucht ist. Die in dieser Arbeit verwendete Methode der Transposonmutagenese lieferte entscheidende Hinweise über die Regulation des sigX-rsiX-Operons. Es konnte gezeigt werden, dass das sigX-rsiX-Operon einer Regulation durch den Transkriptionsterminator Rho unterliegt. Damit wurde das erst dritte Beispiel für eine Termination der Transkription durch den Faktor Rho in B. subtilis bekannt. Als wichtiges Element für die faktorabhängige Termination der Transkription gilt das Vorhandensein einer rut-site, der Bindestelle des Faktors Rho in der naszierenden mRNA. In dieser Arbeit wurden verschiedene Analysetechniken angewandt, um mit Hilfe eines GFP-RsiX-Reporters erstmals eine rut-site in B. subtilis zu kartieren. Die hier identifizierte rut-site von rsiX ist am 5´-Ende dieses Gens lokalisiert. Bei diesen Analysen wurde außerdem deutlich, dass es im sigX-rsiX-Operon zu einer faktorabhängigen intragenischen Termination der Transkription kommt, bei welcher nicht nur die Transkription von rsiX, sondern auch die Expression des stromaufwärts liegenden sigX beeinflusst wird. Punktmutationen in der Sequenz für die rut-site von rsiX zerstörten den Einfluss des Faktors Rho auf das sigX-rsiX-Operon, so dass keine Termination der Transkription mehr stattfand und die detektierbare Menge an sigX-rsiX-Transkript deutlich anstieg. Nur so war es möglich, einen rsiX-Knockout zu komplementieren. Messungen der beta-Galaktosidase-Aktivität eines lacZ-Reporters belegten zudem die Funktion von RsiX als Anti-Sigmafaktor von SigX. Der Verlust des Einflusses von Rho auf das sigX-rsiX-Operon aufgrund einer mutierten rut site machte auch immunologische Nachweise des Anti-Sigmafaktors möglich. Infolgedessen konnte der Frage einer möglichen RsiX-Proteolyse nach dem Vorbild der RsiW-Proteolyse nachgegangen werden. Für RsiW wurde bereits gezeigt, dass ein bestimmtes Stress-Signal den Abbau des Anti-Sigmafaktors einleitet. Die Proteolyse von RsiW erfolgt dann nach dem Mechanismus der regulierten intramembranen Proteolyse (RIP) unter der Beteiligung mehrerer Proteasen. Neben der Beteiligung der Protease RasP an der RsiW-Proteolyse konnte hier auch die Beteiligung von RasP an der RsiX-Proteolyse nachgewiesen werden. Gleichzeitig wurde aber ausgeschlossen, dass die Protease PrsW, welche auch an der RsiW-Proteolyse beteiligt ist, in die RsiX-Proteolyse involviert ist. Demnach können die einzelnen Schritte der RsiW-Proteolyse nicht einfach auf die RsiX-Proteolyse übertragen werden, obwohl es sich bei beiden Transmembranproteinen um Anti-Sigmafaktoren ihrer jeweiligen ECF-Sigmafaktoren handelt.
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Von partikulären Bausteinen zu suprakolloidalen Strukturen finiter Größe
(2011)
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Claudia Simone Wagner
- Im Rahmen dieser Arbeit wurden unter Zuhilfenahme von Templaten komplexe kolloidale Strukturen aufgebaut. Die Herstellung von kolloidalen Clustern, Hybridclustern und nanoporösen Kapseln wurde in Verknüpfung mit theoretischer Modellierung erforscht, um komplexe Bausteine für die Mesotechnologie zur Verfügung zu stellen. Zu diesem Zweck wurden gezielt größere Mengen kolloidaler Cluster hergestellt, wobei erstmals eine Gesamtgröße der Aggregate unter 300 nm erzielt werden konnte. Cluster dieser Größe sind auf Grund der Brownschen Teilchenbewegung stabilisiert, welche der Sedimentation der Cluster entgegenwirkt. Die Clusterherstellung erfolgte durch eine kontrollierte Aggregation kolloidaler Polymer-Bausteine. Dabei wurden Emulsionströpfchen von Öl-in-Wasser-Emulsionen als Template verwendet. Die in derartigen Emulsionen dispergierten Partikel adsorbierten auf Grund des Pickering-Effekts an der Tröpfchenoberfläche. Die Reduktion der Clustergröße wurde durch eine Beschränkung der Primärbausteine auf Polystyrol-Partikel auf Durchmesser kleiner 200 nm und eng verteilte Öltröpfchen im Mikrometerbereich erreicht. Die Tröpfchengrößenverteilung konnte gezielt durch den Einsatz von Ultraschall gesteuert werden. Durch kontrolliertes Verdampfen der Öltröpfchen wurde die Clusterbildung induziert und es kam zu einer Anordnung der Partikel zu Clustern mit definierten Konfigurationen. Durch Zentrifugation in einem Dichtegradienten ließ sich die Suspension in Fraktionen einheitlicher Cluster auftrennen und schließlich mittels rasterelektronischer Aufnahmen definierten Konfigurationen zuordnen. Um in der vorliegenden Dissertation das nächsthöhere Level an Komplexität zu erreichen, wurde das neue Verfahren der Clusterherstellung zur Synthese definierter kolloidaler Hybridcluster eingesetzt, das heißt zum Aufbau von Clustern bestehend aus unterschiedlichen Bausteinen. Zunächst wurden Polystyrol-Cluster nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Diese dienten als Template für eine Adsorption entgegengesetzt geladener anorganischer Nanopartikel auf ihren Oberflächen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass ein hoher Bedeckungsgrad der Clusteroberfläche mit Nanopartikeln mit einer Ladungsumkehr verbunden ist und dies die Herstellung stabiler Suspensionen von Hybridclustern ermöglicht, obwohl sich die Polystyrol-Cluster und die Nanopartikel in ihrer Nettoladung unterschieden. Die Charakterisierung der Hybridcluster durch Rasterelektronenmikroskopie ergab, dass das Abscheiden der Nanopartikel zu einer gleichmäßigen, räumlich separierten Verteilung der Nanopartikel auf der Clusteroberfläche führte. Somit eröffnen sich Perspektiven für Hybride mit einer Kontrolle über Form, Zusammensetzung und Oberflächenrauigkeit. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit einer Strategie zur Herstellung anisometrischer, nanoporöser Kapseln, sogenannten Nanosomen, bestehend aus einer geschlossenen Monolage von Nanopartikeln. Zur Synthese der Nanosome wurden die Erkenntnisse aus den vorangegangenen Arbeiten genutzt: zum einen können geladene Partikel kontrolliert über die Öl- und die Wasserphase in den Emulsionsschritt eingebracht werden und zum anderen können kolloidale Cluster als Template zur Herstellung von Hybriden dienen. Zuerst wurden negativ geladene anorganische Nanopartikel und positiv geladene Polymerpartikel an der Oberfläche von Emulsionströpfchen vereint. Die Emulgierung erfolgte in Anlehnung an das Verfahren zur Herstellung von kolloidalen Clustern. Die entstandenen Heteroaggregate wurden anschließend mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Dabei zeigte sich, dass diese eine Kern-Schale-Architektur besaßen, wobei definierte Polymercluster als Kern fungierten und die Nanopartikel die Schale bildeten. Eine anschließende Entfernung der inneren Template durch Pyrolyse zeigte nanoporöse Kapseln mit komplexer Gestalt, welche durch die Anzahl der Polymerpartikel pro Tröpfchen bestimmt war. Trotz der Monolage der erhaltenen Nanosome waren alle untersuchten Konfigurationen intakt. Zusätzliche theoretische Modellierung erlaubte ein vertieftes Verständnis der Anordnung der Nanopartikel auf den Clustern und eine Aussage zur Stabilität der Nanosome. Durch deren Komplexität und einer bemerkenswert hohen Dichte an Nanoporen könnten die Nanosome somit Anwendung im Bereich der Biomedizin finden. Zusammenfassend dargestellt präsentiert diese Dissertation die Kombination elementarer Bausteine zu mesoskopischen Designer-Aggregaten höherer Komplexität, gepaart mit einzigartigen optischen und magnetischen Eigenschaften.
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Dynamik und Energetik von Triplettexzitonen in konjugierten Polymeren und Molekülen
(2011)
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Sebastian Tim Hoffmann
- Der Markt für elektronische Bauteile wie zum Beispiel organische Leuchtdioden (OLEDs) auf Basis von organischen Halbleitern wächst stetig, daher ist es von immer größerer Bedeutung, die in diesen Materialien ablaufenden Prozesse zu verstehen. Besonders Triplettzustände spielen für OLEDs eine wichtige Rolle. Diese Arbeit beschäftigt sich zum einen mit den Eigenschaften des Transfers von Triplett-Exzitonen und zum anderen mit energetischen Prozessen von Triplettanregungen in organischen Halbleitern. Es wurde die aus der Relaxation des Triplettzustandes resultierende Phosphoreszenz untersucht, insbesondere die zeit- und temperaturabhängige Veränderung ihrer Intensität, sowie die temperaturabhängige Verschiebung der Spektren. Mittels temperaturabhängig gemessener Diffusionsraten konnte gezeigt werden, dass es einen Temperaturbereich der Diffusion gibt, der stark und einen, der kaum temperaturaktiviert ist. Die Gesamtaktivierungsenergie setzt sich dabei aus einem Beitrag der energetischen Unordnung auf Grund der zufälligen Verteilung der Energieniveaus eines Ensembles von Chromophoren und einem proportional zur Reorganisationsenergie zusammen. Letzterer dominiert beim Marcus-Modell oberhalb einer Übergangstemperatur und beschreibt die Energie, die auf Grund von Änderungen in der Elektronendichte aufgebracht werden muss, um die darauf folgende Änderung der Kernabstände zu ermöglichen. Bei tiefen Temperaturen steht nur wenig thermische Aktivierungsenergie zur Verfügung und es dominieren Tunnelprozesse. Hier spielt besonders der Beitrag der energetischen Unordnung eine Rolle. Dieser zweite Mechanismus kann durch die sogenannten Miller-Abrahams Raten beschrieben werden. Um den Einfluss von energetischer Unordnung und Reorganisationsenergie auf den Transfer von Triplettexzitonen besser untersuchen zu können wurde ein Materialsystem auf Grundlage von Poly(p-Phenylen) untersucht, in welchem beide Parameter systematisch variiert sind. Im Vergleich mit einem von Theoretikern erarbeiteten Modell ergab sich eine Abweichung der experimentell ermittelten Parameter bei tiefen Temperaturen. Durch Messungen der spektralen Diffusion der Triplettexzitonen konnte gezeigt werden, dass das im Modell vorausgesetzte Erreichen des thermischen Gleichgewichts in Abhängigkeit der energetischen Unordnung teilweise nicht mehr erfüllt ist und zu einer Frustration der spektralen Relaxation führen kann. Um die experimentellen Ergebnisse zu überprüfen wurden zusätzlich Monte-Carlo-Simulationen durchgeführt. Dabei hat sich zum einen gezeigt, dass sich die Frustration reproduzieren lässt. Zum anderen lassen sich die experimentell bestimmten Triplettdiffusionsraten mit den Miller-Abrahams-Raten im Tieftemperaturbereich und die Marcus-Raten im Hochtemperaturbereich beschreiben und damit auf den Triplett-Transfer anwenden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Bedeutung von Triplettzuständen in Materialien für elektronische Bauteile untersucht. Triplettzustände spielen zum Beispiel für die in OLEDs verwendeten Wirts- und Gast-Materialien eine wichtige Rolle. Als Wirtsmaterialien wurden CBP-Derivate (4,4‘-bis(N-carbazolyl)-2,2‘-biphenyl) untersucht. Alle nichtstrahlenden Zerfälle im Wirtsmaterial führen zu einer Effizienzminderung der OLED, deshalb müssen die in den Materialien stattfindenden Prozesse besser verstanden werden. Die Triplettniveaus in den CBP-Derivaten sind normalerweise hoch genug, damit kein Energietransfer auf den Wirt stattfinden kann. Hier zeigte sich jedoch im Film eine Besonderheit. In Abhängigkeit der Substituenten konnte die Stärke der Ausbildung eines Triplett-Sandwich-Excimers variiert werden, bei dem die Carbazoleinheiten zweier Moleküle überlappen. Wegen des guten Wellenfunktionsüberlapps der Carbazoleinheiten ist bei diesem Excimer die Stabilisierungsenergie sehr hoch und kann daher durch ungewollten Energietransfer vom Gast- auf das Wirtsmaterial die Effizienz mindern. Als Beispiel für Gast-Materialien wurden zusätzlich blau emittierende Ir-Komplexe untersucht. Wegen der benötigten hohen Triplettenergien ist es eine Herausforderung, effiziente blaue Triplettemitter herzustellen. In einer Serie dieser Komplexe konnte an einem blau emittierenden aber ineffizienten Komplex durch Spektroskopie und quantenchemische Rechnungen ein intramolekularer Energietransfer auf den Hilfsliganden identifiziert und Lösungsansätze aufzeigt werden, diesen effizienzmindernden Prozess zu beheben. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in dieser Arbeit wesentliche und fundamentale Aspekte herausgefunden wurden, die das Verständnis des Transfers von Triplettexzitonen erweitern und als Modell für Ladungstransfer allgemein dienen können. Außerdem wurde gezeigt, wie wichtig es ist, effizienzmindernde Prozesse und Zustände, sowohl in Wirts- als auch Gast-Systemen zu verstehen, um damit Strategien zu ihrer Vermeidung entwickeln zu können.
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Applying regional climate change projections for spatio-temporal risk analyses of vector-borne diseases
(2011)
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Dominik Fischer
- Bei vorliegender Dissertation handelt es sich um eine Abhandlung zu vektor-assoziierten Krankheiten in Zeiten des Klimawandels. Bei vektor-assoziierten Krankheiten wird ein Pathogen durch einen Vektor (Überträger), auf ein Wirtstier übertragen. Als solche Vektoren agieren meist Arthropoden. Klimatische Veränderungen beeinflussen vektor-assoziierte Krankheiten insbesondere dadurch, dass Arthropoden ihre Körpertemperatur nicht selbst regeln können und zudem bestimmte Temperaturansprüche zur Pathogenentwicklung im Vektor erfüllt sein müssen. Das Klimaänderungssignal des 21. Jahrhunderts wird von Klimamodellen in verschiedenen räumlichen und zeitlichen Auflösungen wiedergegeben. Die Projektionen beruhen auf Emissionsszenarien klimawirksamer Treibhausgase. In der Arbeit werden die Einsatzmöglichkeiten von regionalen Klimamodellen zur Gefährdungsabschätzung anhand verschiedener Fallbeispiele aufgezeigt. Deren Nutzen und Einsatzmöglichkeiten werden einführend aufgeführt. Für die Risikoanalysen werden regionalen Klimamodelle REMO und COSMO-CLM angewandt, die durch dynamisches „Downscaling“ globaler Modelle generiert wurden. Beide sind in ihrem neuesten Prozesslauf in das globale Modell ECHAM5 eingebettet. Der direkte Übertrag bekannter Temperaturansprüche von Vektor und/oder Pathogen auf künftig zu erwartende Bedingungen stellt den ersten methodologischen Schwerpunkt dieser Arbeit dar. Eine Amplifikation des Dengue-Virus im Überträger der Stechmücke Aedes aegypti könnte demnach zunächst in Südeuropa, im weiteren Verlauf des 21. Jhd. aber auch in weiteren europäischen Regionen möglich sein. Weiterhin verdeutlichen die Ergebnisse, dass sich auch das Zeitfenster einer potentiellen Übertragung des Dengue-Virus verlängern kann. Durch das Überlagern der bekannten Temperaturansprüchen von Sandmücken (Gattung Phlebotomus) und der von ihnen übertragbaren Erreger - Leishmania infantum Komplex - können potentielle Regionen Deutschlands identifiziert werden, in denen einer autochthone Übertragung der Leishmaniose möglich ist. Es ist zu erwarten, dass ein solches Risiko zunächst in südwestlichen und westlichen Regionen Deutschlands, im späteren Verlaufe des des 21. Jhd. jedoch auch für eher nördlich und östlich gelegene Regionen bestehen wird. Der zweite innerhalb dieser Arbeit gewählte methodologische Ansatz zeigt die Einsatzmöglichkeiten regionaler Klimaprojektion für die bioklimatische Nischenmodellierung von Krankheitsüberträgern auf. Die anhand statistischer Verfahren ermittelte bioklimatische Nische der jeweiligen Art wird hierbei auf zukünftig zu erwartende klimatische Bedingungen übertragen. Anhand dieser Analyse kann aufgezeigt werden, dass sich die klimatische Eignung für die invasive Stechmücke Aedes albopictus (Überträger mehrere human-pathogener Viren) ausgehend von westlichen Regionen Europas über Mitteleuropa und schließlich Osteuropas erhöhen wird. Der Transfer der ermittelten spezifischen klimatischen Nische ausgewählter Sandmücken-Arten (u.a. Überträger der zum Leishmania-Komplex zählenenden Pathogenen) auf künftige Bedingungen lässt vermuten, dass deren klimatische Eignung in Mitteleuropa - abgesehen von alpinen Regionen - zunehmen wird. Künftige potenzielle Ausbreitungswege der Sandmücken in einer sich verändernden Umwelt, werden via “least-cost analysis“ ermittelt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass aufgrund der eingeschränkten natürlichen Ausbreitungsfähigkeit, einige der künftig potenziell geeigneten Lebensräume nicht erreicht werden. In den verschiedenen Fallstudien kann gezeigt werden, dass die zu erwartenden klimatischen Veränderungen im 21. Jhd. eine mögliche Ausbreitung der in dieser Arbeit adressierten Vektoren und vektor-assoziierter Krankheiten in Europa begünstigen werden. Als einheitliche Tendenz kann speziell für Mitteleuropa festgehalten werden, dass sich die Gefährdung, Ende des 21.Jhd. erhöhen wird. Dies begründet sich höchstwahrscheinlich durch die projizierte raschere Erwärmung in der zweiten Jahrhunderthälfte. Abschließend bleibt jedoch festzuhalten, dass es neben klimatischen Veränderungen weitere Faktoren für die Ausbreitung bzw. Neuetablierung von Vektoren und den damit verbundenen übertragbaren Infektionskrankheiten ausschlaggebend sind. Der Einfluss einzelner Faktoren auf die Etablierung bzw. Ausbreitung vektor-assoziierte Krankheiten variiert auf raum-zeitlichen Skalen. Für die ermittelten klimatisch-abgeleiteten Risikogebiete sollten in Folgestudien auf kleineren Skalen wirksam werdenden Faktoren integriert werden. Diese Ergebnisse können wiederum die Entwicklung von Surveillance- und Monitoringprogramme unterstützen, um somit Maßnahmen gegen die Ausbreitung von vektor-assoziierten Krankheiten initiieren zu können.
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Strukturelle Untersuchungen an dem Radikalenzym (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase
(2011)
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Stefan Knauer
- In der Natur werden viele chemisch schwierige Reaktionen von Radikalenzymen katalysiert. Die (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase katalysiert die Dehydratisierung von (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA in der Fermentation von L-Leucin im humanpathogenen Bakterium Clostridium difficile. Im Gegensatz zu einer Vielzahl von Radikalenzymen, wie beispielsweise der Coenzym B12-abhängigen bakteriellen Klasse II Ribonukleotid-Reduktase oder der S-Adenosylmethionin-abhängigen Biotin-Synthase, benötigt die (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase keine komplexen Kofaktoren zur Erzeugung des katalytisch aktiven Radikals. Stattdessen verwendet sie ein einzelnes, hoch energetisches Elektron. Bei der Dehydratisierung – einer atypischen α/β-Eliminierung – werden reduktiv Ketylradikale im Substrat erzeugt. Die Dehydratase muss zunächst aktiviert werden, indem ein Aktivator, der ein [4Fe-4S]-Zentrum enthält, unter ATP-Hydrolyse ein Elektron auf die Dehydratase überträgt. Für den Aktivator werden im Laufe des Aktivierungsprozesses Nukleotid- und redox-abhängige Konformationsänderungen angenommen. Das hoch reaktive Elektron wird nach jedem Substratumsatz wieder auf die Dehydratase übertragen, so dass bis zu 10.000 Umsätze katalysiert werden können, bevor eine erneute Aktivierung notwendig ist. Die strukturelle Grundlage der Aktivierung sowie die Art und Weise, wie das aktive Elektron in der Dehydratase nach erfolgtem Umsatz wiedergewonnen und vor Verlust durch unspezifische Nebenreaktionen geschützt wird, ist unbekannt. In dieser Arbeit konnte zunächst die Struktur der homodimeren (E)-2-Isocaprenoyl-CoA:2-Hydroxyisocaproat-CoA-Transferase gelöst werden, die in der Fermentation von L-Leucin den zweimaligen Transfer eines Coenzym A-Moleküls katalysiert. Sie gehört zur Familie III der CoA-Transferasen und besitzt deren typische Faltung. Ein Aspartatrest im aktiven Zentrum ist wahrscheinlich an der Ausbildung von kovalenten Intermediaten beteiligt. Es wurden die Strukturen des reduzierten Aktivators ohne Nukleotid, mit ADP und mit dem ATP-Analogon ADPNP bestimmt. Der homodimere Aktivator gehört zur Actin-Faltungsfamilie und die Monomere sind durch ein verbrückendes [4Fe-4S]-Zentrum miteinander verbunden. Jedes Monomer besteht aus zwei Domänen, die in Abwesenheit eines Nukleotids eine offene und in Gegenwart eines Nukleotids eine geschlossene Konformation einnehmen. Die Strukturen des reduzierten Aktivators mit gebundenem ADP und ADPNP zeigten keine signifikaten Konformationsunterschiede. Der Vergleich mit der Struktur eines oxidierten Aktivators ergab, dass auch die Reduktion des [4Fe-4S]-Zentrums offenbar keine strukturellen Änderungen zur Folge hat. Möglicherweise spiegeln die Strukturen, die alle mittels Röntgenkristallographie bestimmt wurden, jedoch nicht die konformationelle Flexibilität in Lösung wider. Erstmals wurde die Komplexbildung zwischen dem Aktivator und der Dehydratase mittels ADPNP nachgewiesen. Die Strukturen des Aktivators legen nahe, dass die Komplexildung über den Prozess der konformationellen Selektion geschieht. Die Struktur der Dehydratase zeigte, dass das heterodimere Protein zwei [4Fe-4S]-Zentren in einem Abstand von 12 Å beinhaltet. Jedes Fe/S-Zetrum ist von drei Cysteinresten und einem terminalen Liganden koordiniert. Das Fe/S-Zentrum in der α-Untereinheit ist Teil des aktiven Zentrums und besitzt in Abwesenheit von Substrat ein Hydroxyidion/Wassermolekül als vierten Liganden. Das Substrat ersetzt diesen Liganden und koordiniert das Fe/S-Zentrum mit dem Carbonylsauerstoffatom der Thioestergruppe. Das [4Fe-4S]-Zentrum in der β-Untereinheit hat eine Sulfhydryl-/Sulfidogruppe als terminalen Liganden und fungiert als Speicher für das Elektron, wenn kein Substrat anwesend ist. Die Struktur der (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase dient als Modell für die Familie der 2-Hydroxyacyl-CoA-Dehydratasen und der Gruppe der phylogenetisch verwandten Benzoyl-CoA-Reduktasen.
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Isolierung, Strukturaufklärung und Totalsynthese von Alkaloiden aus Stenus Käfern und der Seeanemone Heteractis aurora
(2011)
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Tobias Müller
- Die neuen Pyridinalkaloide (Z)- und (E)-3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin konnten jeweils in den Pygidialdrüsen der Kurzflügelkäfer Stenus solutus und S. similis als Hauptkomponenten nachgewiesen werden. Die Norverbindung 3-(1-Isobutenyl)-pyridin wurde als Minderkomponente in S. solutus, S. cicindeloides, S. binotatus und S. pubescens gefunden. Die Strukturen wurden durch NMR-Spektroskopie und Vergleich mit synthetischen Referenzen aufgeklärt. Die Pyridine wurden durch Umsetzung von Nicotinaldehyd mit dem jeweiligen Phosphoniumsalz nach WITTIG in einer Stufe erhalten. Für das bekannte Spreitungs- und Abwehralkaloid Stenusin, welches in den meisten Käfern der Gattung Stenus vorkommt, wurde eine neuartige Syntheseroute entwickelt. Die Stenusin enthaltenden Steninae zeigen eine charakteristische Zusammensetzung aller vier Stereoisomeren. Alle bislang bekannten stereoselektiven Zugänge zu Stenusin, wie auch die auf der SAMP/RAMP-Methode basierende Varinate nach ENDERS et al., erlauben nur die Darstellung der in der Seitenkette (S)-konfigurierten Alkaloide (2S,3R)- und (2S,3S)-Stenusin. Daher wurde eine neue Synthese entwickelt, die es erlaubt, alle Isomere selektiv darzustellen. Das Stereozentrum im Piperidinring wird durch auxiliarvermittelte asymmetrische Hydrierung erzeugt, während die Seitenkette entweder aus dem chiralen Pool ((S)-2-Methylbutanol) entnommen wird – identisch mit der Variante nach ENDERS – oder mittels einer chemoenzymatischen Synthese erzeugt wird. Insbesondere die (2S,3R)- und (2S,3S)-Isomere lassen sich ausgehend von 3-Brompyridin und (S)-2-Methylbutylbromid in einer sehr kurzen Sequenz von nur 4 Stufen in guter Ausbeute darstellen. Weiterhin erfolgt die gesamte Synthese frei von Schutzgruppen. Das verwendete EVANS-Auxiliar kann nach der Hydrierung unverändert wiedergewonnen werden. Das neue Alkaloid Cicindeloin wurde aus Stenus-Käfern der Art S. cicindeloides isoliert und dessen Struktur durch NMR-Spektroskopie in Verbindung mit EI- und ESI-Massenspektroskopie aufgeklärt. Die Absolutkonfiguration von Cicindeloin konnte durch stereoselektive Totalsynthese und GC-Vergleich mit dem Naturstoff an einer chiralen Phase bestimmt werden. Es wurde ein totalsynthetischer Zugang mit 20% Gesamt¬ausbeute entwickelt, der eine lineare Sequenz von 12 Stufen umfasst, von denen neun ohne Chromatographie auskommen.
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Charakterisierung des humanen Proteins MCM8 und seiner Interaktion mit CDC45
(2011)
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Linda Holtkamp
- In der eukaryotischen und archaealen DNA-Replikation spielen MCM-Proteine eine bedeutende Rolle. Ein heterohexamerer Komplex der Proteine MCM2-7 stellt in eukaryotischen Zellen die replikative Helikase dar, welche den DNA-Doppelstrang entwindet und so für die Replikation durch die DNA-Polymerasen zugänglich macht. In den Archaea übernimmt diese Aufgabe ein homohexamerer MCM-Komplex. Ein weiteres Mitglied der eukaryotischen MCM2-7-Familie ist MCM8. Es gibt Hinweise, dass MCM8 als homohexamere Helikase in der eukaryotischen DNA-Replikation involviert ist, die tatsächliche Funktion des Proteins ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Durch Untersuchungen von Tumorgeweben wurde gezeigt, dass humanes MCM8 in den entsprechenden Zellen akkumuliert oder mutiert vorliegt. Dies lässt darauf schließen, dass MCM8 an der Entwicklung von Tumoren beteiligt sein könnte. Für das Verständnis der Krebsentstehung ist daher die Erforschung seiner Funktion von großer Wichtigkeit. Ziel dieser Arbeit war zunächst, ein geeignetes Expressionssystem zu etablieren, in welchem rekombinantes humanes MCM8 löslich exprimiert und aufgereinigt werden kann. Hierfür wurden Expressionsstudien in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae sowie Sf9- und High-Five-Insektenzellen durchgeführt. In S. cerevisiae konnte keine Expression von MCM8 detektiert werden, da das Protein hier möglicherweise toxisch wirkt. In E. coli konnte MCM8 nach einer Co-Expression mit dem Chaperon E. coli Triggerfakor bei einer Expressionstemperatur von 15°C teilweise löslich exprimiert werden. In Insektenzellen konnte MCM8 sowohl in plasmidbasierter transienter Expression als auch in einer Baculovirus-basierten Expression vollständig löslich exprimiert werden. Das lösliche rekombinante MCM8 wurde mittels Affinitäts-, Heparin- sowie Ionenaustausch- chromatographie aufgereinigt und auf enzymatische Aktivität untersucht. Es war bekannt, dass die anderen MCM-Proteine eine DNA-abhängige ATPase-Aktivität besitzen, und dass diese durch die Mutation eines konservierten Lysinrests im aktiven Zentrum des Proteins ausgeschaltet werden kann. Um eine eventuelle ATPase-Aktivität MCM8 zuordnen zu können, wurde die Aktivität des Wildtyp-Proteins sowie die Aktivität der mutmaßlichen ATPase-Motiv-defekten Mutante MCM8 K460E überprüft. Weder für das in E. coli noch für das in Insektenzellen exprimierten rekombinanten Protein konnte eine ATPase-Aktivität nachgewiesen werden. Auch durch Zugabe von DNA konnte diese Aktivität nicht stimuliert werden. Dies ließ darauf schließen, dass humanes MCM8 alleine in vitro keine enzymatische Aktivität besitzt. Vermutlich benötigt MCM8 wie der MCM2-7-Komplex in vivo Cofaktoren zur Ausübung seiner Funktion. CDC45 und der GINS-Proteinkomplex gelten als essentielle Cofaktoren der Helikase MCM2-7, welche zusammen als CMG-Komplex den DNA-Doppelstrang entwinden. Wenn MCM8 als Helikase in die DNA-Replikation der eukaryotischen Zelle involviert ist, ist eine Interaktion mit CDC45 wahrscheinlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Interaktion von MCM8 mit humanem CDC45 nach Co-Expression der rekombinanten Proteine in High Five-Insektenzellen untersucht. Hinweise auf eine Interaktion von MCM8 und CDC45 ergaben sich zunächst durch eine Co-Aufreinigung der rekombinanten Proteine Strep_MCM8 und His_CDC45 mittels Talon- und anschließender Strep-Tactin-Chromatographie, in welchen beide Proteine in beiden Aufreinigungs-schritten co-eluierten. Einen weiteren Hinweis lieferte die Co-elution der Konstrukte MCM8_H10 und CDC45 in einer Gelfiltration. Durch Immunopräzipitation von MCM8_H10 und CDC45 aus High-Five-Zellextrakten, wo beide Proteine mit dem jeweiligen Interaktionspartner co-präzipitierten, konnte gezeigt werden, dass MCM8 und CDC45 in vitro interagieren. Eine in vivo-Interaktion der beiden Proteine wurde in HeLa-Zellen untersucht. Hier ergab sich ein Hinweis auf die Interaktion durch Immunopräzipitationen von CDC45 mit einem MCM8-Antikörper aus Zellextrakten logarithmisch wachsender HeLa-Zellen. Die Untersuchung fraktionierter Zellextrakte synchronisierter HeLa-Zellen lieferte Informationen über den Zeitpunkt und den Ort der Interaktion von MCM8 und CDC45 im Zellzyklus. Es ist bekannt, dass die Proteine MCM2-7 vor allem zu Beginn der Synthese-Phase chromatingebunden vorliegen. Hier konnte gezeigt werden, dass MCM8 und CDC45 gegen Ende der Synthese-Phase und am Übergang der G2- zur Mitose-Phase verstärkt chromatingebunden vorliegen. Dies lässt darauf schließen, dass das humane MCM8 eher in die Elongation als in die Initiation der eukaryotischen DNA-Replikation involviert ist. Es ist ebenfalls denkbar, dass MCM8 eine bisher noch nicht untersuchte regulatorische Funktion besitzt. Die tatsächliche Rolle von MCM8 im eukaryotischen Zellzyklus bleibt weiterhin unklar, bedarf jedoch gerade im Hinblick auf seinen potenziellen Wert als Tumor-Marker weiterer Aufklärung.
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Constraint-System für eine mehrschichtige Metamodellierungsumgebung
(2011)
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Michael Zeising
- In vielen Bereichen wird die Bewältigung von komplexen Problemstellungen durch Modelle unterstützt. Modelle beschreiben Software-Systeme, geschäftliche Abläufe, Kommunikationsbeziehungen zwischen Menschen und vieles mehr. Sogenannte Metamodelle beschreiben dabei die Struktur und Bedeutung von Modellen, dienen also als „Sprache“ für deren Formulierung. Die meisten Modellierungswerkzeuge sind eng an ein bestimmtes Metamodell gekoppelt, können also nur zur Entwicklung einer bestimmten „Art“ von Modellen dienen. Ein Ansatz flexiblere Werkzeuge zu erhalten besteht darin, zwischen der Repräsentation und der Bedeutung von Modellen zu trennen. Ein flexibles Werkzeug basiert dann auf einem Metamodell, dass lediglich die Repräsentation von Modellen beschreibt und kann damit zur Entwicklung von Metamodellen selbst dienen. Zu Beginn der Entwicklung eines Modells darf das Werkzeug so wenige Einschränkungen wie möglich vorgeben. Für bestimmte Anwendungsfälle sind hingegen strikte Regeln für die Form eines Modells sinnvoll. Das Werkzeug muss es daher ermöglichen einem Modell je nach Bedarf Regeln bezüglich seiner Struktur aufzuerlegen. Für viele inhaltliche Zusammenhänge wären sehr komplexe Modelle notwendig um alle Randbedingungen präzise zu erfassen und manches lässt sich unter Umständen mit den Mitteln der Modellierungssprache überhaupt erst gar nicht ausdrücken. Auch inhaltlich muss es daher möglich sein, dass Modell durch beliebige Randbedingungen zu verfeinern. In dieser Arbeit wird eine Sprache zur Formulierung solcher Randbedingungen (engl. constraints) entwickelt. Diese dienen einerseits dazu, die Modellierungssprache selbst einzuschränken, ermöglichen also den oben erwähnten Wechsel zwischen freien und strikten Modellierungsparadigmen. Andererseits ermöglicht sie eine inhaltliche Verfeinerung von Modellen über die Modellierungssprache hinaus.
