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Chemische Modifikation von siRNAs zur Verbesserung der zellulären Aufnahme
(2006)
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Andrea Forst
- Um therapeutisch wirksam zu sein, muss eine siRNA die Zellmembran überwinden und ins Zytoplasma gelangen. Auf Grund der negativen Ladung unmodifizierter Nukleinsäuren und des hohen Molekulargewichts ist eine passive Permeation ins Zytoplasma unwahrscheinlich. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, durch die Anknüpfung kleiner Moleküle an den 5´-Terminus des Sense Strangs einer siRNA deren Aufnahme ins Zytoplasma zu erreichen. Hierzu wurden verschiedene siRNA-Konjugate synthetisiert, welche in einem in vitro Modellsystem ohne Verwendung eines Transfektionsreagenzes die posttranskriptionelle Hemmung der apoB Genexpression in Leberparenchymzellen ermöglichen. Ein erster Ansatz zielte auf die Erhöhung der Hydrophobizität der siRNAs und eine damit verbundene Erleichterung der zellulären Annäherung. Als Grundbausteine dienten Lithocholsäure, Cholesterin, Betulin und 3-Beta-Cholestanol. Durch kurze organisch chemische Synthesesequenzen wurden diese Verbindungen in das entsprechende Phosphoramidit überführt, um eine Kopplung während der RNA-Festphasensynthese zu ermöglichen. Unter Verwendung verschiedener Linker konnte das Spektrum der Modifikationen erweitert werden. Des Weiteren wurde versucht, durch Amidbindungsknüpfung zwischen einer NHS-Ester aktivierten siRNA und verschiedenen Aminen, kationischen Aminosäuren und Dipeptiden, die Lipophilie der siRNA zu erhöhen. So sollte eine Aufnahme über Zellpenetration, bestimmte Aminosäurekanäle oder Nährstofftransporter erreicht werden. In einem weiteren Ansatz wurde eine definierte Rezeptor-vermittelte Aufnahme nach Glykokonjugation der siRNA mit linearen und verzweigten Galaktose-Strukturen zur Überwindung der Zellmembran angestrebt. Hierzu wurde beta-D-Galaktosepentaacetat in ein Phosphoramidit umgewandelt und während der RNA-Festphasensynthese verschiedene siRNA-Konjugate synthetisiert. Zunächst wurden die Eigenschaften der modifizierten siRNAs untersucht. Anhand von Transfektionsexperimenten wurde deren Aktivität im Hinblick auf die posttranskriptionelle Hemmung der apoB Genexpression gezeigt. Mit Hilfe eines Membranintegritätstests konnten keine zytotoxischen Eigenschaften für die verwendeten Zelllinien detektiert werden. Der Fokus der folgenden Dosis-Wirkungs-Experimente richtete sich auf die Galaktose-konjugierten Nukleinsäuren. Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung konnte sowohl in An- als auch in Abwesenheit eines Transfektionsreagenzes für das SBGAL- und SBTEGGAL-Konjugat nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Glykokonjugation von verzweigten Galaktose-Strukturen an siRNAs konnte in dieser Arbeit erstmals eine definierte Rezeptor-vermittelte Aufnahme über den Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR) gezeigt werden. Infolge dessen war eine posttranskriptionelle Hemmung der apoB Genexpression in humanen Leberkarzinomzellen möglich. Durch Stimulation dieses Rezeptors mit Kalziumchlorid konnten die beobachteten RNA-Interferenz-Effekte erheblich gesteigert werden. Die SBGAL-modifizierte siRNA bewirkte in einer Konzentration von 10 µM eine 70%ige Reduktion der apoB m-RNA, während mit dem SBTEGGAL-Konjugat eine Abnahme des m-RNA Gehalts um 90% gezeigt werden konnte. Anhand fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen Cy3-markierter SBGAL- und SBTEGGAL-Konjugate wurde eine Internalisierung dieser siRNAs ins Zytoplasma deutlich gemacht, wobei durch Aktivierung des Rezeptors eine vermehrte Aufnahme der siRNAs ins Zytoplasma zu beobachten war. In den durchgeführten Kompetitionsstudien wurde durch Zusatz des stärker an den Rezeptor bindenden Liganden N-Acetylgalaktosamin eine Internalisierung der siRNAs verhindert und es konnten keine RNA-Interferenz-Effekte mehr detektiert werden. Alle Experimente zur Dosis-Wirkung, Rezeptorstimulation sowie die Kompetitionsstudien wurden mit vergleichbaren Ergebnissen in einer Rattenleberkarzinomzelllinie bestätigt. Diese Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung von RNAi-basierenden Therapeutika und eröffnen neue Möglichkeiten für die gezielte Ablieferung von siRNAs in Leberparenchymzellen bei kommenden in vivo Experimenten.
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Naturstoffe aus Heilpflanzen und marinen Organismen
(2006)
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Daniela Grote
- Die Korallen Dendronephthya rubeola, Sinularia asterolobata und Sarcophyton tenuispiculatum sowie der Schwamm Desmacidon tubular sind zuvor noch nicht auf ihre Inhaltsstoffe untersucht worden. Von den Korallen Palythoa sp., Nephthea sp., Litophyton arboreum, Sarcophyton trocheliophorum, Sarcophyton glaucum, Sinularia polydactyla und Sarcophyton sp. und der Alge Enteromorpha flexuosa ist bekannt, dass sie pharmakologisch aktive Sesquiterpene und Diterpene enthalten. An Land lebende Pflanzen produzieren viele Naturstoffe mit häufig wichtigen biologischen Eigenschaften, Funktionen und Wirkungen. Zizyphus spina-christi und Solenostemma argel werden bis heute als Heilpflanzen in der traditionellen Medizin wie z. B. bei der Behandlung von Entzündungen, Leber- und Nierenerkrankungen und Hautproblemen eingesetzt, wobei die pharmakologischen Aktivitäten vor allem auf Triterpensaponine und Flavonglycoside zurückzuführen sind. Daher bestand das Ziel dieser Arbeit in der Isolierung und Strukturbestimmung bioaktiver Naturstoffe aus marinen Organismen und Heilpflanzen. Die Testung auf pharmakologische Wirksamkeit erfolgte am Hans-Knöll-Institut in Jena. Das unterschiedliche Verhalten jeder Stoffklasse und die Komplexität der Substanzgemische erforderten individuelle Lösungen der Trennprobleme, indem jeweils spezielle Aufarbeitungsoperationen entwickelt wurden. Zur Isolierung der Naturstoffe fanden Säulenchromatografie an Kieselgel und Sephadex LH-20, MPLC und präparative Dünnschichtchromatografie an RP- und Kieselgel-Phasen Anwendung. Die Strukturbestimmung der isolierten Verbindungen erfolgte überwiegend mittels Kernspinresonanzspektroskopie. Die Zuordnung der Signale wurde mithilfe der zweidimensionalen homonuklearen NMR-Technik 1H,1H-COSY und den heteronuklearen Experimenten HMQC und HMBC ermittelt. Die relative Konfiguration wurde durch die Auswertung von ROESY-Spektren festgelegt. Die Analyse der Steroidgemische erfolgte nach Trimethylsilylierung mittels GC-MS-Messungen. Aus den Heilpflanzen Zizyphus spina-christi und Solenostemma argel konnten Triterpensaponin 1 und Pregnan-Derivat 4 isoliert werden. Die Koralle Sarcophyton trocheliophorum lieferte das Cembran-Diterpen (-)-7b-Hydroxy-8a-methoxydeepoxysarcophin (16), das aus der Natur zum ersten Mal isoliert werden konnte. Die Koralle Sinularia polydactyla beinhaltete die zwei neuen Cembranoide (+)-Polydactylid (19) und (+)-7a,8b-Dihydroxydeepoxysarcophin (20), wobei letzteres durch präparative Fermentation von (+)-Sarcophin mit Absidia glauca bekannt ist. Aus der bereits intensiv untersuchten Koralle Sarcophyton sp. gelang die Isolierung von zwei neuen Cembran-Diterpenen (+)-17-Hydroxysarcophytoxid (23) und (+)-7b-Acetoxy-8a-hydroxydeepoxysarcophin (24), das durch Umsetzung von Sarcophin mit 1%iger p-Toluolsulfonsäure in Essigsäure partialsynthetisch bereits hergestellt wurde. Die Koralle Sinularia asterolobata lieferte das neue Furanocembranoid (-)-Danielid (29). Es gelang in dieser Arbeit aus Dendronephthya rubeola vier neue Capnellene 34-37 und ein neues Präcapnellen 38 zu isolieren. Eine Auswahl der isolierten Naturstoffe wurde auf pharmakologische Wirkungen untersucht. (-)-3a-Ethoxyfuranocembranoid 28, (+)-13a-Acetoxypukalid (31) und Furano-cembranoid 32 zeigen gute antiproliferative Aktivität gegenüber den Tumorzelllinien L-929 (Mäusefibroblasten) und K-562 (Humanleukämie). Die beiden Capnellene (+)-D9(12)-Capnellen-8b,10a-diol (39) und (-)-8b-Acetoxy-D9(12)-capnellen-10a-ol (40) weisen eine gute antiproliferative Wirkung gegenüber Tumorzelllinie L-929 und eine gute cytotoxische Aktivität gegenüber der HeLa-Zelllinie (humanes Cervix Karzinom) auf. Des Weiteren wurden 39 und 40 in Hefe Transkripitions-Assays getestet. Die Sesquiterpene 39 und 40 sind gute Inhibitoren der Protein-Protein-Interaktion des onkogenen c-Myc-Transkriptionsfaktors mit seinem Partnerprotein Max, wobei 39 das beste Ergebnis mit einer 77% Hemmung aufweist. Verbindungen mit inhibitorischer Wirkung gegen den Myc/Max-Komplex sind in der Onkologie von therapeutischem Interesse, da dieser Komplex als potenter Aktivator eine Reihe von Genen reguliert, deren Genprodukte Einfluss auf die Zelltransformation zur Folge haben.
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Untersuchungen zur Stabilität von Tensidschäumen
(2006)
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Christian Fehn
- Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zum Einfluss von Silikonölen bzw. von Compounds aus Silikonölen und darin dispergierten SiO2-Partikeln mit Größen im Mikrometer-Bereich durchgeführt. Hierzu wurden Öle mit einer Polydimethylsiloxan- bzw. einer Polyphenylmethylsiloxanstruktur im Viskositätsbereich von 5–350 mm2/s verwendet. Es wurde gefunden, dass die entschäumende Wirkung der Systeme Öl+hydrophobe Partikel durch Zusatz von Silikonharze stark erhöht werden kann. Um die Ursache für die Deaktivierung von Entschäumern aufzuklären, wurden Schäume durch kontinuierliches Einleiten von Stickstoff durch Glasfritten erzeugt. Es wurde nachgewiesen, dass die SiO2-Partikel durch scherinduzierte Koagulation ihre Wirkung verlieren. Dieser Effekt tritt auch ein, wenn die schaumfreie Volumenphase mit den Öl/Partikel-Tröpfchen über Tage hinweg gerührt wird. Die im Silikonöl dispergierten Kieselsäurepartikel erleiden nach längerer Lagerungsdauer in Kontakt mit Tensidlösungen unerwartete Modifikationen, die makroskopisch visualisierbar sind. Es wurde nachgewiesen, dass die wässrige Phase durch hydrophile Kanäle in den aggregierten SiO2-Partikeln in das Innere der Ölphase eindringen und dort Wasserinseln bilden kann. Zur weiteren Aufklärung des Verhaltens wurden Modellsysteme gewählt. Für die Untersuchung des Verhaltens der Grenzfläche Öl/wässrige Phase erwiesen sich silikonölreiche Gele als nützlich. Dies sind silikonölgefüllte bifluide Schäume mit Zellen im Mikrometer-Bereich. Es wurde gefunden, dass die Silikon-Entschäumeröle mit Tensidlösungen nach analogen Gesetzen, wie es für die kohlenwasserstoffreichen Gele der Fall ist, Gele bilden. Die Aufnahmefähigkeit an Silikonöl erreicht mit zunehmender Tensidkonzentration cT ein Maximum. Die Abnahme der Sättigungskonzentration oberhalb dieser Tensidkonzentration skaliert mit cT^m, wobei m=–1,44 bis –1,01. Die Größenverteilung der Schaumzellen wurde mikroskopisch ermittelt und kann durch eine logarithmische Normalverteilung sehr gut beschrieben werden. Die mittleren Radien der Schaumzellen sind proportional zum Reziprokwert der Quadratwurzel aus der Tensidkonzentration. Erstmals wurde gefunden, dass die maximale Aufnahmefähigkeit an Silikonöl bei einem konstanten Verhältnis aus Öl/Wasser-Grenzfläche und Zahl der Tensidmoleküle erreicht wird. Weitere Skalierungsgesetze wurden angegeben: durch Zugabe von Saccharose wurde ermittelt, dass beispielsweise die maximale Ölaufnahmefähigkeit der Gele proportional zum Reziprokwert der Quadratwurzel der Lösungsviskosität ist. Partikelzusatz verringert die Stabilität der ölreichen Gele. In Gegenwart hoher Konzentrationen von Silikonharz kann sich die Lebensdauer der sonst jahrelang stabilen Gele auf wenige Tage verringern. Als Modellsysteme für die Oberfläche der SiO2-Partikel erwiesen sich Objektträger aus Glas als geeignet. Aus den Kontaktwinkeln kann auf die schaumfilmdurchbrechende Wirkung der Kieselsäurepartikel geschlossen werden. Es wurde gefunden, dass die hydrophobierende Behandlung der Oberflächen in Gegenwart von Silikonharz zu einer Verminderung deren Benetzbarkeit mit wässriger Phase führt. Hierdurch werden die Kontaktwinkel in Richtung stärkerer Schaumzerstörung eingestellt. Diese Wirkung wird aber nur erreicht, wenn die Silikonharzbehandlung der Glasoberflächen in der Hitze in Gegenwart von KOH/MeOH durchgeführt wird. Spreitungsexperimente erwiesen sich als wertvoll zur weiteren Verdeutlichung der Silikonöl- und Partikelwirkung. Durch Beobachtung der befreiten Fläche eines Polyeder- oder Kugelschaumteppichs wurde bestätigt, dass Silikonöle während ihrer Spreitung auf wässrigen Lösungen kaum schaumzerstörend wirken. Erst der Zusatz hydrophober Kieselsäurepartikel bewirkt eine deutliche Zerstörung von Schaumzellen bereits während der Spreitung. Der Zusatz von geeigneten Silikonharzen vermag diese Wirkung enorm zu verstärken. Die Erklärung der optimierenden Wirkung von Silikonharzen gelang mit Hilfe von Oberflächenspannungs- und Kontaktwinkelmessungen. Silikonharz verstärkt die Hydrophobierung der SiO2-Partikel. Dadurch sind diese besser in der Lage, die mit Tensidmolekülen bedeckte Wasser/Luft-Grenzfläche zu durchdringen. Infolge der sich an diesen Eintritt von Öltröpfchen in die Grenzfläche Wasser/Luft anschließenden Kontaktwinkeleinstellung wirken Öltröpfchen dann verstärkt schaumzerstörend, wenn die Grenzflächenspannung Öl/Luft kleiner wird. Eine stärkere Schaumzerstörung durch den Zusatz von Silikonharz kann nur dann erfolgen, wenn das Silikonharz diese initiale Oberflächenspannung des Öls verringert. Durchstichexperimente mit hydrophilen und hydrophoben Glasnadeln erklären in elementar anschaulicher Weise die beschriebenen Zusammenhänge.
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Structure-based theoretical characterisation of the redox-dependent titration behaviour of cytochrome bc1
(2006)
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Astrid Klingen
- Cytochrome bc1 is a coenzyme-Q-cytochrome-c-oxidoreductase that represents complex III of the mitochondrial respiratory chain. It spans the inner mitochondrial membrane and uses the free energy of electron transfer from coenzyme Q (CoQ) to cytochrome c to shift protons across the membrane. The chemical energy of reduced CoQ is thus converted into the energy of a proton motive force. The coupling between electron transfer and proton translocation is based on the Q-cycle mechanism. This mechanism comprises two CoQ-binding active sites, that catalyse the oxidation/deprotonation and reduction/protonation of CoQ, respectively. The two sites are located at opposite sides of the membrane. Their intricate chemistry is a matter of ongoing debate. This thesis describes a structure-based theoretical approach to characterise redox-linked protonation state changes in cytochrome bc1, that are at the heart of its catalytic mechanism. The analysis of the titration behaviour of cytochrome bc1 is however complicated by its membrane environment, its high number of titratable sites, their interaction with each other and with redox-active groups, and the conformational variability of the CoQ oxidation site. A series of four studies has prepared the grounds to approach this challenging system. The first article analyses the effect of conformational variability and electrostatic interaction on the titration behaviour of simple model systems (Manuscript A). Based on this study, the coupling between conformational and protonation state changes has been analysed in a relatively simple soluble protein (Manuscript B). The effect of pH on the position of CoQ in a CoQ-reducing transmembrane protein has been quantified as described in Manuscript C. Manuscript D presents a study of the coupling between redox and protonation reactions of the Rieske iron-sulphur cluster, that is one of the prosthetic groups of cytochrome bc1. Based on crystal structures of cytochrome bc1 from Saccharomyces cerevisiae, the protonation probabilities of all titratable groups in the protein have then been calculated, once for its completely oxidised state and once for its completely reduced state. The results allow to identify individual residues that undergo redox-linked protonation state changes. They are consistent with the results of Fourier transform infra-red spectroscopy, and aid in the often complicated interpretation of these experimental data. The calculation results reveal a modified path for proton uptake to the CoQ reduction site (ManuscriptE). In the CoQ oxidation site (Manuscript F), the population of protonation and conformational states is consistent with a previously proposed gating mechanism of the catalytic reaction, that may help to prevent harmful bypass reactions. Coupling between the reduction and protonation of both the Rieske cluster and haem bL highlight the importance of these cofactors in the combined oxidation and deprotonation of CoQ.
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Kombinatorische Untersuchung und Optimierung von organischen Multischichtleuchtdioden
(2006)
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Markus Bäte
- Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Weiterentwicklung und Verbesserung der an diesem Lehrstuhl vorhandenen Aufdampfanlage zur Herstellung von komplex aufgebauten Multischichtleuchtdioden. Um eine verbesserte Kontrolle der Schichtdicken und der Aufdampfrate zu ermöglichen wurden im Rahmen der Doktorarbeit in der Aufdampfkammer drei widerstandsgeheizte Quellen durch drei Effusionsquellen ersetzt. An diese drei Effusionsquellen wurden zusätzliche Sensoren, zur Bestimmung der Aufdampfrate und Schichtdicke, angebracht. Um den Gradienten in der Schichtdicke, der, abhängig von der Quellenposition, während des Aufdampfprozesses entsteht, zu reduzieren, wurde der vorhandene feststehende Maskenschlitten durch einen Drehteller mit Maskeneinheit ersetzt. Dieser Drehteller rotiert während des Aufdampfprozesses über den Quellen. Er bietet alle kombinatorischen Möglichkeiten des Maskenschlittens zur Sektoren- und Gradientenerzeugung. Mit dem Drehteller konnte der gerätebedingte Gradient der aufgedampften Schichten auf bis unter 7 % reduziert werden. Ein weiteres Ziel, die Leuchtdioden vor Luftsauerstoff und Feuchtigkeit zu schützen und damit die Lebensdauer zu erhöhen, wurde verwirklicht durch den Anbau einer Inertgaskammer an die Aufdampfanlage, in der fertig gestellte Leuchtdioden verkapselt werden können. Schließlich wurde, für eine schnelle Charakterisierung kombinatorischer Sektorenbibliotheken, eine neue Apparatur, der FLASHScan® 530, in Betrieb genommen. Mit diesem Gerät ist es möglich sowohl Absorptions- als auch Lumineszenzspektren von kombinatorischen Sektorenbibliotheken schnell und effizient durchzuführen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es mit der weiterentwickelten Aufdampfanlage möglich ist effektiv organische Leuchtdioden herzustellen und, insbesondere, dass mittels neu entwickelter kombinatorischer Sektorenbibliotheken in einem Versuch verschiedene Parameter, wie z.B. Schichtabfolge, variiert und die Sektoren miteinander verglichen werden können. Neben der Weiterentwicklung der Aufdampfanlage lagen weitere Schwerpunkte auf der Untersuchung und Optimierung von grün, rot und blau emittierenden Substanzen in organischen Leuchtdioden.
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New Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy in Materials Science
(2006)
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Heiko Zettl
- In this work we have developed new concepts for the usage of fluorescence correlation spectroscopy. A classical FCS setup was modified in such a way that fluorescent species in aqueous as well as organic environments can be studied at varying temperature. We have synthesised a set of dye-labelled polymers that served as a well-defined system to study polymer diffusion and that was used to characterise the beam path and focal volume in environments with refractive indices different from that of water. Furthermore a new method for the labelling of ionic species was developed. The adaptation of the microscope optics to non-aqueous environments was done by replacing the present microscope objective by a multi-immersion objective. Secondly, a sample chamber was developed that was not only resistant to organic solvents in all parts but also allowed temperature control of the solution. Determining diffusion coefficients of polymers in solution and their concentrations requires the exact knowledge of shape and size of the observation volume. For this purpose we have synthesised a set of polystyrenes with molecular weights ranging from 4 to 1550 kg/mol each chain being labelled with a single dye molecule. All species were anionically polymerised in order to grant a very low polydispersity and with this a high reliability in the determination of the observation volume. This concept can be transferred to other solvents and, hence, shows an easy way to calibrate fluorescence correlation microscopes to different solvents and to investigate non-aqueous solutions. Furthermore, we have shown exemplarily for polystyrene that FCS is capable of determining the crossover between the dilute and the semi-dilute concentration regime. Dye-labelled polymer chains were mixed with unlabelled polymer chains of the same length and their mobility was measured by FCS for different mixing ratios. The change of the mobilities leads to the respective overlap concentrations, which are shown to follow a scaling law in a range of molecular weights from 4 to 1550 kg/mol. This is in excellent agreement with the predictions made by Flory and Huggins. The data shown demonstrate that FCS can measure diffusion properties in ranges that were not accessible before. Another part of this work focusses on concepts to monitor the aggregation of molecules by FCS. Taking low-molecular-weight surfactants as an example it is shown that with the help of Coulomb interaction cationic surfactants can be labelled with anionic dye molecules and vice versa. Moreover, micelle formation is observed already at concentrations slightly below the critical micelle concentration found with classical methods. This findings are in excellent agreement with the predictions made by Israeliachvili in the 1990ies. Additionally, it was demonstrated that by using insoluble dye molecules, which are incorporated by the forming aggregates, aggregate formation can be followed by FCS on a single-molecule level. This procedure was shown to work in both aqueous and organic polymer solutions. The high sensitivity of FCS permitted to determine the critical aggregation concentration of Janus micelles in THF to the very low value of around 8 mg/L. No other experimental method available today is capable of determining aggregation concentrations in such a low concentration regime. In the same way the critical aggregation concentration of block copolymer polystyrene-Amylose in THF was determined. Finally, temperature-dependent correlation curves allowed the determination of reaction constants and enthalpies. This is of particular interest in biochemical contexts, as the amount of available material can be minute. Exemplarily, the binding enthalpy of an RPA protein to a single-stranded DNA strain is determined by temperature-dependent correlation curves. The modifications made to a classical FCS setup were shown to enhance the spectrum of possible applications to new experimental fields. The methods and concepts developed in the framework of this thesis are expected to play an important role in meeting future challenges of polymer physics and microbiology.
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Thermodynamische Stabilisierung von Proteinen durch in vitro Evolution und biophysikalische Analyse ihrer molekularen Grundlagen
(2006)
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Michael Wunderlich
- Proteine sind zentrale Bausteine des Lebens und ihre dreidimensionale Struktur ist für die Funktion von entscheidender Bedeutung. Deswegen ist das Verständnis der konformationellen Stabilität von Proteinen von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Selektionssystem Proside zur Stabilisierung von Proteinen genutzt. Proside basiert auf der phage display Technologie und verknüpft die thermodynamische Stabilität von Proteinen mit der Infektiosität von filamentösen Phagen. Die bakteriellen Kälteschockproteine werden sowohl von experimenteller, als auch theoretischer Seite als Modellproteine zur Untersuchung der Stabilität von Proteinen genützt. Es ist bekannt, dass elektrostatische Wechselwirkungen auf der Oberfläche von sehr großer Bedeutung für ihre Stabilität sind. Deswegen sollte versucht werden, alternative Ladungsnetzwerke auf der Oberfläche des Kälteschockproteins Bs-CspB aus B. subtilis unter Verwendung von in vitro Evolution zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden Reste anhand von Sequenz- und Strukturvergleichen mit homologen Proteinen ausgewählt und diese Positionen partiell randomisiert. In einem zweiten Ansatz wurden zufällig Mutationen in das Gen von Bs-CspB eingeführt. Nach erfolgter in vitro Evolution der jeweiligen Bibliotheken konnten an sechs oberflächenexponierten Positionen stabilisierende Mutationen identifiziert werden. Die Beiträge dieser Mutationen zur thermodynamischen Stabilität von Bs-CspB wurden analysiert. Die beste Kombination war, mit einem Schmelzpunkt von 83,7°C im Vergleich zu 53,8°C vom Wildtypprotein, sogar stabiler war als das hyperthermophile Homologe Tm-Csp aus T. maritima. Einen beachtlichen Beitrag zu dieser deutlichen Stabilisierung liefern dabei verbesserte Coulomb´sche Wechselwirkungen. Die Beiträge sind dabei jedoch sehr stark von der Umgebung abhängig. Vergleiche der experimentellen Daten mit vorhandenen theoretischen Betrachtungen offenbarten die Schwierigkeiten, Coulombsche Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche korrekt zu berechnen und deren Einfluss auf die thermodynamische Proteinstabilität zu bestimmen. Ein theoretischer Ansatz, welcher unter Verwendung eines quasi-elektrischen Dipolmomentes die Einflüsse von Veränderungen der Ladungsverteilung auf die Stabilität vorhersagte, konnte experimentell nicht verifiziert werden. Ebenso konnten keine Korrelationen zwischen Veränderungen der Stabilität und der Nettoladung des Proteins festgestellt werden und auch keine Korrelation mit der Bildung von Ionenpaaren hergestellt werden. Ebenso wie Bs-CspB stellt auch die b1 Domäne des Streptokokkenproteins G ein Modellprotein zur Untersuchung von thermodynamischer Stabilität dar. In der Gruppe von S. Mayo wurde dieses Protein unter Verwendung von computational design untersucht. Dabei zeigte sich, dass die vier teilweise exponierten Reste ein sehr großes Stabilisierungspotential besitzen. Eine in vitro Evolution dieser vier Positionen durch das Selektionssystem Proside bot somit die Möglichkeit, die Leistungsfähigkeit der beiden Methoden direkt zu vergleichen. Die Selektionen lieferten eine Vielzahl von deutlich stabilisierten Proteinvarianten. Für die stabilste Variante war der Mittelpunkt des thermischen Überganges um 24,7°C erhöht. Die beste Variante aus dem computational design lag von allen untersuchten Varianten auf dem dritten Platz. Sieben der zehn berechneten Varianten, welche in den Kalkulationen alle annähernd gleich stabil waren, enthielten einzeln oder in Kombination die Aminosäurereste L18 und K29. Diese beiden Reste erwiesen sich bei der experimentellen Charakterisierung als sehr ungünstig. Um die Ursachen für diese Unterschiede zu ergründen, wurde von zwei Varianten die dreidimensionale Struktur bestimmt. Zusätzlich wurden die enthaltenen Mutationen einzeln und in unterschiedlicher Kombination thermodynamisch charakterisiert. Dabei zeigten sich bei der Analyse die Schwierigkeiten, strukturelles Verhalten in experimentelle energetische Terme zu übersetzen, was der Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse bei der Stabilisierung durch in vitro Evolution und computational design sein dürfte. Im Folgenden sollten für beide Schritte auf dem Weg zur Stabilisierung, der Auswahl von Positionen und dem Finden der besten Aminosäurereste, ein experimentelles Herangehen genützt werden. Durch Selektion von Bibliotheken mit zufälligen Mutationen, erstellt mittels fehlerhafter PCR, konnten viel versprechende Positionen identifiziert werden. Diese wurden dann einer Sättigungmutagenese mit anschließender Selektion unterworfen und die gefundenen Mutationen der beiden stabilsten Varianten wurden abschließend manuell kombiniert. Die erhaltene Variante besaß einen um 35,1°C erhöhten Übergangsmittelpunkt. Bei der Analyse der Ursachen zeigte sich, dass in diesem Fall starke hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den durch diese Mutationen eingeführten Seitenketten wirken. Dies zeigt, dass zur Stabilisierung von Proteinen vielfältige Wege beschritten werden können.
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Fused and spiro furanones from tetronic acid synthons: Oxa and azacycles featuring the butenolide ring
(2006)
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Juan-Manuel Urbina-Gonzalez
- Diverse 4-O-allyl tetronates were obtained by reaction of allyl (alpha-hydroxy)carboxylates with keteneylidenetriphenylphosphorane (Ph3PCCO) in a domino reaction (addition – Wittig olefination) and by direct allylation of tetronic acid via Fischer esterification. 3-Allyl tetronic acids were generated by Claisen rearrangement of 4-O-allyl tetronates under microwave conditions; a subsequent Conia reaction produced the corresponding spiro cyclopropane furan-2,4-diones. Nucleophilic ring opening with diverse alcohols converted the spiro cyclopropane furan-2,4-diones to 3-beta-alkyloxypropyltetronic acids. When using O-benzyl isourea for the 4-O-alkylation of 3-allyl tetronic acids, the 3-benzyl derivatives were also formed (five examples were prepared). The Mitsunobu reaction proved to be a better way for the 4-O-alkylation of 3-allyl tetronic acids. 3,3-Diallyldihydrofuran-2,4-diones with two identical allyl residues were obtained by Tsuji-Trost-type Pd-catalysed allylation of either 4-O-allyltetronates or 3-allyltetronic acids. Pd assisted allylation of sodium 3-allyltetronate with a second allyl acetate gave mixed derivatives as did the Claisen rearrangement of 4-O-allyl 3-allyltetronates under microwave conditions. 3,3-Diallyldihydrofuran-2,4-diones were converted to butanolides with 3,3-spirocyclopentenyl or 3,4-cycloalkanyl annulation by ring closing methathesis with Grubbs’ catalysts. Natural product pesthetoxin was prepared via a double Ph3PCCO addition to alpha-hydroxy benzyl octanoate, thus demonstrating the utility of keteneylidenetriphenylphosphorane as a C2O building block. Finally, (-)-3-epi-blastmycinolactol was prepared enantioselectively via double hydrogenation of 3-but-2-enyl tetronic acid.
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NMR Studies on Termination/- Antitermination Complexes of HIV-1 Transcription
(2006)
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Nageswara Rao Jampani
- After HIV enters the host cell the viral RNA is reverse transcribed into double stranded DNA and then integrated into the host genome. At this step, transcription of HIV RNA by Rpol II is tightly regulated by several cellular factors including NELF, DSIF, and pTEFb, and the virus encoded Tat protein. The work presented in this thesis is mainly focussed on understanding the mechanism of termination and antitermination of HIV-1 transcription. Some of the cysteines in the wild type HIV-1 Tat are required for the Zn2+ dependent interaction with pTEFb, but not needed for the binding of TAR RNA in vitro. These cysteines are readily oxidised and leading to the protein aggregation. Thus, a mutant, Tat-Cys-, lacking all cysteines was used for binding studies with TAR RNA. 1H-15N HSQC and 1H-1H TOCSY spectra were measured to monitor the interaction between Tat-Cys- and TAR RNA. The results presented indicate Tat-Cys- is binding to TAR RNA around the bulge region and is able to induce a conformational change in TAR RNA. This is further supported by observing a change in the CD signal at 265 nm upon addition of Tat-Cys- to TAR RNA. {1H}-15N steady state NOE experiments showed that the core region of Tat remains unstructured even in the complex with TAR RNA. Based on the NMR and CD spectroscopic data presented in this thesis, and data published by others it is tempting to speculate that the core and basic regions of Tat-Cys- remain unstructured upon binding to TAR RNA. Furthermore, the solution structure of the RNA binding domain of NELF-E, NELF-E RRM, was determined using multidimensional NMR spectroscopy. The data reveal that the structure of NELF-E RRM exhibits a babbab topology. The atomic coordinates were deposited in the protein data bank (pdb) under the accession code 2BZ2. RNA binding studies were performed with TAR RNA and various oligoribonucleotides. NMR studies with NELF-E RRM:TAR complexes indicate NELF-E RRM binds to various RNAs in a very similar manner but with different affinities. Mapping of chemical shift perturbations on the structure of NELF-E RRM indicate that the RNA binding interface is mainly located on the b-sheet surface. Large chemical shift perturbations are observed for the residues located in the flexible C-terminal region of NELF-E RRM and in the loop between b3 and a2. Among the various RNAs tested, TAR49-57 displayed the highest affinity to NELF-E RRM. Further structural characterisation of the NELF-E RRM:TAR49-57 complex revealed that the C-terminal region of NEFL-E RRM adopts a small 310 helix around the b3-a2 loop and is stabilised by several hydrophic interactions. The C-terminal region of NELF-E RRM in the RNA bound conformation is very close to the RNA binding interface and could be involved in the RNA binding. However, further structural characterisation of NELF-E RRM in the complex with RNA will be needed to fully understand the mechanism of RNA recognition.
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New Carbazole Based Materials for Optoelectronic Applications
(2006)
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Martin Sonntag
- The motivation for this thesis was the synthesis, characterization and the testing of new, environmentally stable materials based on aromatic amines for OFET and OLED applications. The preparation of high quality thin films from solution as well as from the gas phase was an another important issue. The first part of this thesis deals with star-shaped molecular glasses with triphenylamine as core molecule. Substituted fluorene and carbazole units were attached to the core molecule as side arms via a trifold Suzuki cross coupling reaction. The target compounds were highly purified by medium pressure liquid chromatography (MPLC) as purity is an important prerequisite for organic materials to be used for optoelectronic applications. Before the new materials were finally tested in transistor devices, a suitable surface treatment of the OFET substrates was developed. By introducing self-assembled monolayers, prepared from hexamethyldisilazane (HMDS), on top of the SiO2 insulator layer of the FET substrates, the field-effect mobility was increased by at least one order of magnitude. Furthermore it was possible to improve on/off-ratios as well as turn on voltages. In conclusion hole carrier mobilities up to 3 x10-4 cm2/Vs and on/off-ratios of 10000 were achieved from the new star-shaped compounds. The performance of the devices was not affected by a four month storage period in air and daylight. The second part of this thesis describes the synthesis and characterization of a new class of fused heterocycles based on carbazole units. For this issue a series of bisindenocarbazoles is introduced as a new class of fused heterocycles. A synthetical procedure was designed which allows to tailor the thermal properties of the target compounds by introducing different alkyl substituents in the very last step of the synthesis. Yields up to 50 % can be obtained after six synthetical steps including purification of the intermediates. CV measurements showed the electrochemical stability of the novel compounds. Altogether five bisindenocarbazoles with different alkyl substitution patterns have been prepared and characterized. Their morphology varies from highly crystalline materials with short alkyl side chains to amorphous molecular glasses if longer or branched alkyl groups are attached to the core. As the bisindenocarbazoles exhibit a bright blue fluorescence together with high quantum yields, they were tested as blue emitter for OLED applications. In typical setups for blue light emitting LEDs, the blue emitter is doped into a wide band gap host material in order to avoid quenching of the electroluminescence and to adjust the energy levels of the different materials used in the setup. For this issue CBP, mCP and TCTA were tested as matrix materials together with a bisindenocarbazole as emitter. A combinatorial evaporation setup was used for the preparation of the OLED devices in order to dope the different host systems by co-evaporation of the bisindenocarbazole dye. This deposition method also allows the variation of the film thicknesses of the charge transport layers in a single experiment. By using this device architecture a deep-blue emission from the bisindenocarbazole dye at CIE color coordinates of x = 0.19 and y = 0.17 was obtained at a hole blocking layer thickness of 40 nm. Luminance values up to 200 cd/m2 were achieved with this series of devices. The turn on of the light emission was observed at 5 V. These very first results show that the bisindenocarbazole is a promising new blue fluorescent emitter for organic LEDs. Due to the rigid rod-like core of the bisindenocarbazole it was possible to obtain a novel derivative exhibiting a broad nematic mesophase by extending the core with aromatic side groups. By using a suitable alignment method, it is possible to obtain well ordered LC monodomains from which increased charge carrier mobilities can be obtained. The nematic LC phase was characterized with polarizing microscopy (POM) and small angle X-ray scattering (SAXS).
