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Strukturelle Untersuchung des Antiterminationskomplexes von EIAV (2002)

Marc Ehnert

In der vorliegenden Arbeit wurden strukturelle Untersuchungen am Antiterminationskomplex von EIAV durchgeführt. Die Auswertung von Tripleresonanz-NMR-Experimenten ermöglichte die sequentielle Zuordnung der Resonanzen von 13C/15N-markiertem EIAV-Tat. Zum ersten Mal konnten mit Hilfe dieser Zuordnung strukturelle Veränderungen des Proteins bei der Wechselwirkung mit TAR-RNA, Cyclin T1 und dem Inhibitor TF53 auf der Basis einzelner Aminosäuren direkt in einem 15N-1H-HSQC-Spektrum beobachtet werden. Es konnte gezeigt werden, dass das EIAV-Tat-Protein ohne die Beteiligung weiterer Bindungspartner an die TAR-RNA bindet. Bei dieser Bindung erfahren die Core-Domäne (Tyrosin-35 bis Tyrosin-49) und das argininreiche Motiv (ARM; Arginin-55 bis Lysin-63) von EIAV-Tat strukturelle Veränderungen, wobei auch der zwischen diesen beiden Domänen liegende Linker (Leucin-50 bis Leucin-54) betroffen ist. Auf RNA-Ebene deutet die Analyse der Imino-Protonen-Verschiebungen auf strukturelle Veränderungen bei der Tat-Wechselwirkung hin, die sich aber auf den Stamm der RNA nur wenig auswirken, so dass von einer Bindung an die ungepaarten Basen der Loopregion ausgegangen werden kann. Die Untersuchung der Interaktionen von EIAV-Tat mit TF53 – einem Inhibitor der HIV-Tat/TAR-Bindung – ergab, dass dieser auch an das virale Protein aus EIAV bindet und dabei – ähnlich wie die TAR-RNA – strukturelle Veränderungen der Core- und ARM-Region induziert. Die Veränderungen des Tat-Proteins, die bei der TF53-Bindung beobachtet wurden, stimmen mit denen der TAR-Bindung zu einem großen Teil überein; Unterschiede sind nur bei wenigen Resonanzen zu erkennen. Offensichtlich bindet der Inhibitor zwar nicht an alle Aminosäuren, die bei der Wechselwirkung mit TAR-RNA beteiligt sind. Beispielsweise sind die für die TAR-Bindung wichtigen Reste Arginin-55 und Asparagin-58 hier nicht betroffen. TF53 bedingt aber ähnliche strukturelle Veränderungen des Tat-Proteins, so dass die TAR-Bindung gehemmt werden könnte. Die Wechselwirkungen von EIAV-Tat mit dem Wirtsfaktor Cyclin T1 wurden anhand verschiedener Systeme untersucht. Da die Reinigungen von Pferde-Cyclin T1 (eCycT1) und einer His-tagged Form von eCycT1 trotz erfolgreicher Expression beider Proteine in E. coli nicht zu einer ausreichend konzentrierten Lösung führten, wurde die Reinigung einer V29L-Mutante von humanem Cyclin T1 (hCycT1_V29L) mittels Ammoniumsulfat-Fällung und einer hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) etabliert. Das an EIAV-Tat bindende hCycT1_V29L konnte bis zu 80 µM konzentriert werden. Erste CD- und NMR-spektroskopische Untersuchungen belegen, dass sowohl eCycT1 als auch hCycT1_V29L hauptsächlich a-helikale Strukturelemente besitzen. Es konnte zudem gezeigt werden, dass hCycT1_V29L Wechselwirkungen mit EIAV-Tat über Leucine eingeht. Dabei sind neben einigen bereits in der TAR-Bindung involvierten Resten der Core- und Linker-Region auch die Leucine-74 und 75 beteiligt. Aufgrund der schlechten Löslichkeit der 272 Aminosäuren großen CyclinT1-Proteine wurden zudem Untersuchungen mit verkürzten Cyclin-Varianten durchgeführt, die nur die wichtigen amino- und carboxyterminalen Bereiche von Cyclin T1 – verbunden durch einen FKSG-Linker – enthielten. Das daraus abgeleitete synthetische Peptid Mini_eCyc_45 und das etwas längere in E. coli überexprimierte und über Heparin-Sepharose gereinigte Mini_eCyc_75 zeigen in CD- und 1D-NMR-Spektren keine reguläre Sekundärstruktur. Beide Mini-Cycline gehen mit EIAV-Tat nur geringe Wechselwirkungen ein, die sich lediglich bei der Interaktion mit Mini_eCyc_75 in wenigen Verschiebungen der Seitenketten-Resonanzen im 15N-1H-HSQC beobachten lassen. Eine Verstärkung der zwischen zwei Bindungspartnern auftretenden Wechselwirkungen wurde bei der Untersuchung von ternären Interaktionen zwischen EIAV-Tat, TAR-RNA und Mini_eCyc_45 beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Mini_ eCyc_45 zusätzliche strukturelle Veränderungen der TAR-RNA bewirkt. Anhand der Veränderungen im 15N-1H-HSQC von EIAV-Tat konnte ebenso gezeigt werden, dass sich – ähnlich wie bei der Bindung von hCycT1_V29L an Tat – wahrscheinlich mehrere Leucine an dieser ternären Interaktion beteiligen.

Virale Regulatoren der Transkription - Klonierung, Expression und Reinigung von CAEV-Tat, HK022Nun und lambda N(1-53) sowie ihrer Wirtsfaktoren JunbZIP (222-331) und E. coli NusA (2002)

Sabine Schwarz

In dieser Arbeit wurden drei virale Regulator-Proteine (CAEV-Tat, HK022 Nun und l N (1-53)) und mehrere ihrer nicht-viralen Bindungspartner kloniert, exprimiert, gereinigt und strukturell charakterisiert. CAEV-Tat (Caprines Arthritis-Enzephalitis-Virus) ist ein Transaktivatorprotein aus einem HIV-verwandten Lentivirus der Ziege. Zur effizienten Expression von CAEV-Tat war es notwendig, einige seltene Codons des tat-Gens gegen die jeweils synonymen, aber in E. coli häufiger verwendeten Codons auszutauschen. Ferner mußte eine in E. coli seltene Arginin-tRNA (argU) koexprimiert werden, um die für NMR-Spektroskopie nötigen Proteinmengen herstellen zu können. Expression und Reinigung von CAEV-Tat mittels Standardverfahren wie Metallionenaffinitätschromatographie über einen Histidinanhang oder die Expression und Reinigung als GST-Fusionsprotein waren nicht erfolgreich. Daher mußte ein individuell auf CAEV-Tat zugeschnittenes Reinigungsprotokoll etabliert werden. Aufgrund seines hohen pIs von 11 konnte CAEV-Tat über Kationenaustauscher-Chromatographie an CM-Sepharose und anschließende Hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt werden. Die Ausbeuten an Protein ließ sich durch Verwenden von Heparin-Sepharose als Kationenaustauscher-Material noch weiter steigern. CAEV-Tat zeigte in CD- und NMR-Spektren typische Charakteristika eines a-helikalen Proteins. Da CAEV-Tat in Konzentrationen über 400 µM aggregierte und daher nicht für weitere NMR-spektroskopische Untersuchungen, die höher Konzentrationen voraussetzen, geeignet war, wurde eine cysteinfreie Mutante von CAEV-Tat kloniert und nach dem für das Wildtyp-Protein etablierten Protokoll gereinigt. Die Mutante erwies sich als weitaus NMR-tauglicher und zeigte keinerlei Aggregationstendenzen bei Konzentrationen von 1 mM. Durch NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, daß Wildtyp-Protein und cysteinfreie Mutante strukturell identisch sind. Somit steht mit der cysteinfreien Mutante ein für weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen geeignetes Konstrukt zur Verfügung. Für das CAEV-Tat homologe Maedi-Visna-Virus-Tat-Protein war eine Interaktion mit der basischen und der Leucin-Zipper-Domäne der beiden zellulären Transkriptionsfaktoren Jun und Fos postuliert worden (Morse et al., 1999). Für spätere Vergleichsstudien mit CAEV-Tat und Jun / Fos zu ermöglichen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mit der Beschaffung der entsprechenden Nukleotidsequenzen und der Generierung expressionsfähiger Klone von c-jun, c-fos sowie und fosbZIP bereits wichtige Voraussetzungen für spätere Bindungsstudien mit NMR-Spektroskopie geschaffen. JunbZIP (222-331) konnte bereits erfolgreich als GST-Fusionsprotein exprimiert und über Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose gereinigt werden. Nun aus dem lambdoiden Phagen HK022 fungiert bei einer Superinfektion des Wirts mit dem l-Phagen als Terminator der viralen Genexpression. Um spätere Strukturuntersuchungen an diesem System durchführen zu können, mußte zunächst ein auf die E. coli codon usage optimiertes synthetisches Gen für Nun generiert werden. Hierbei erwies sich die Methode nach Kim (1989) als erfolgreich. HK022 konnte mit Ausbeuten von 70 mg/l Kulturmedium über Kationenaustauscher-Chromatographie mit Heparin-Sepharose gereinigt werden. Erste strukturelle Befunde (CD, HSQC-Spektren, Messung des hydrodynamischen Radius) deuten darauf hin, daß es sich bei Nun um ein Protein mit nur gering ausgeprägter Tertiärstruktur handelt. Ein Fragment (1-53) des Antiterminator-Protein N aus dem Phagen l konnte kloniert und als Fusionsprotein mit Ubiquitin exprimiert werden. Die Reinigung erfolgte über Affinitätschromatographie und einen abschließenden RP-HPLC-Schritt nach der Abspaltung des Ubiquitinanteils. l N-Protein liegt in Lösung unstrukturiert vor. Dieser Befund wurde auch für das N(1-53)-Peptid durch CD-Spektroskopie und die Bestimmung des hydrodynamischen Radius erhalten. Bei der Bindung von 15N-N(1-53) an nutboxB-RNA bildet sich ein Komplex, der höchstwahrscheinlich weitgehend die gleiche Struktur wie der Komplex aus N(1-36) und nutboxB-RNA besitzt. Bei Zugabe des Wirtsfaktors NusA aus E. coli zu diesem binären Komplex kommt es auf Seiten von l N (1-53) zu Veränderungen im HSQC-Spektrum, was auf eine spezifische Interaktion zwischen dem längeren l-Peptid und NusA hindeutet. Hiervon sind vor allem die nicht im Komplex mit nutboxB vorliegenden Reste von l N betroffen. Weitergehende NMR-spektroskopische Untersuchungen werden klären, inwieweit die nutboxB-RNA an der Interaktion mit NusA beteiligt ist. Mit der Etablierung eines Reinigungsprotokolls für N(1-53) und für E. coli NusA konnten wichtige Voraussetzungen hierfür bereits erfüllt werden.

Strukturbestimmung des Birkenpollenallergens Bet v 4 (2002)

Jörg Nerkamp

Bet v 4 ist ein minores Allergen aus Birkenpollen (Betula verrucosa). Es gehört zur Familie der Polcalcine, kleinen Calcium bindenden Allergenen mit je 2 EF-Hand Strukturmotiven, die in einer Vielzahl höherer Pflanzen gefunden werden. Es wurden effektive Strategien zur Präparation von rekombinantem Bet v 4 entwickelt, die auch eine Markierung mit dem Isotop 15N erlaubten. Zwei hervorstechende Eigenschaft von Bet v 4 wurden bei der Reinigung ausgenutzt: Bet v 4 ist ein saures Protein, was eine Reinigung mittels Chromatofokussierung erlaubte. Aufgrund seiner Thermostabilität konnte Bet v 4 durch Kochen eines Proteinrohextraktes von hitzelabilen bakteriellen Proteinen abgetrennt werden. Somit stand genügend Bet v 4 zur Verfügung, um eine strukturelle Charakterisierung durchzuführen und letztendlich seine Struktur mittels NMR-Spektroskopie zu bestimmen. Anhand von ESI-MS, nativer PAGE und NMR-Diffusionsmessungen konnte gezeigt werden, dass Bet v 4 monomer vorliegt. Die strukturelle Charakterisierung mittels CD-Spektroskopie wies auf einen hohen Anteil alpha-helicaler Strukturelemente in der Calcium-Form hin, der anhand der chemischen Verschiebungen von alpha-Protonen, helixtypischer NOEs und vicinaler Kopplungskonstanten bestätigt wurde. Der Entzug von Calcium hat eine Verringerung des CD-Signals, jedoch keinen kompletten Verlust der Sekundärstruktur zur Folge. NMR-Spektren ließen vermuten, dass Apo-Bet v 4 keine geordnete dreidimensionale Struktur mehr besitzt. Der strukturelle Einfluss von Calcium weist mehr auf eine regulatorische Funktion von Bet v 4 als Calcium-Sensorprotein denn auf auf eine Funktion als Calcium-Speicherprotein. Durch die Auswertung von homonuklearer 2D- und heteronuklearen 3D-Spektren konnte die Struktur von Calcium gebundenem Bet v 4 gelöst werden. Die beiden EF-Hand-Motive sind durch einen flexiblen Linker miteinander verbunden und werden durch ein kurzes Faltblatt zusammengehalten. Während die beiden Calciumbindungsschleifen und die sie unmittelbar flankierenden Regionen eine starre Struktur eine aufweisen, sind die terminalen Bereiche experimentell unterbestimmt, was jedoch mit den Daten aus NMR-Relaxationsmessungen übereinstimmt, die in diesen Bereichen eine erhöhte Flexibilität nachwiesen. Der Aminoterminus ist relativ unstrukturiert. Die Kenntnis der Struktur einer Vielzahl von Allergenen wird womöglich eine Antwort auf die Frage liefern, was ein Protein zum Allergen macht.

Zweikernige Metallocenkomplexe als Katalysatorvorstufen für die homogene und heterogene alpha-Olefinpolymerisation (2002)

Matthias Deppner

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Synthese und Charakterisierung von unverbrückten, zweikernigen Metallocenkomplexen und deren optimierter Einsatz in der homogenen und heterogenen, katalytischen Olefinpolymerisation. Es wurde untersucht, wie sich die Polymerisations- und Polymereigenschaften der dinuklearen Katalysatoren von denen vergleichbarer einkerniger Metallocenkomplexe unterscheiden. Insbesondere war die Frage von großem Interesse, ob sich die Polydispersitäten der mit Hilfe der zweikernigen Katalysatoren erhaltenen Polymere durch Veränderungen von Polymerisationsparametern in stärkerem Maße beeinflussen lassen als bei einer Mischung von vergleichbaren einkernigen Katalysatoren. Es wurden 13 symmetrische und 57 asymmetrische, zweikernige Metallocenkomplexe dargestellt, wobei Modifizierungen an der Ligandstruktur, der Brückenlänge, den Substituenten und den Zentralmetallen vorgenommen wurden. Um auf Vergleichsdaten bei der Olefinpolymerisation zurückgreifen zu können, wurden zwei einkernige Komplexe synthetisiert, die sich von der Struktur der zweikernigen Verbindung ableiten. Die Charakterisierung der Komplexe erfolgte mit Hilfe von Multikern NMR Spektroskopie, Elementaranalyse und Massenspektroskopie.

Entwicklung und Optimierung einer allgemeinen Strategie zur Synthese von multiantennären N-Glycanen des „bisecting“-Typs (2002)

Harald Weiß

Eine interessante und gleichzeitig schwierig zu synthetisierende Klasse von Oligosacchariden sind die N-Glycane des bisecting-Typs. Bisecting-Verbindungen sind an der beta-Mannose des Core-Trisaccharids neben der 3- und 6-Position auch an der 4-Position glycosyliert. Eine starke gegenseitige sterische Hinderung erschwert die Ein-füh-rung der drei benachbarten glycosidischen Bindungen. Aufbauend auf einem modularen System von Oligosaccharidbausteinen gelingt die Synthese von biantennären N-Glycanen (5), die anschließend in einer späten Phase mit dem bisecting-GlcNAc-Rest versehen werden. Um diese Reaktion zu verbessern, wurden sechs neue Glucosaminylfluoride synthetisiert und sowohl mit Cyclohexanol als auch mit dem Heptasaccharid 5 zur Reaktion gebracht. Es stellte sich heraus, daß der sterische Anspruch und die Reaktivität mit Cyclohexanol nur in geringem Maße Rückschlüsse auf die Eignung der Donoren für eine bisecting-Reaktion zulassen. Ein Hauptproblem bestand in der schwierigen Reinigung der auf diesem Weg dargestellten bisecting-Verbin-dun-gen. Zur Darstellung biantennärer Systeme scheinen benzylierte Donoren am besten geeignet, allerdings waren die zusätzlichen Benzylschutzgruppen am bisecting-Octasaccharid 48 nur schwer hydrogenolytisch abzu-spal-ten. Es wurden daher neue Reagentien zur Aktivierung von Glycosylfluoriden entwickelt und unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen geprüft. Ferner wurden Thioglycoside und Trichloracetimidate als Glycosyldonoren in diesen Systemen getestet. Für biantennäre Systeme lieferte die späte Einführung des bisecting-Restes Verbindungen, deren Aufreinigung in ausreichenden Ausbeuten möglich war. Für höher-an-ten-näre N-Glycane gelang das nicht. Daher wurde die Reihenfolge der Einführung der Substituenten am beta-Mannosid grundlegend geändert. Über die frühe Einführung des bisecting-Restes war es erstmals möglich, einen allgemeinen Zugang zu bisecting-N-Glycanen in zufriedenstellenden Ausbeuten zu entwickeln. Das Ziel wurde vor allem durch die Verwendung der kleinen Trifluoracetamido-Schutzgruppe am bisecting-Rest erreicht. Die Synthese des Hexasaccharids 83 stellte eine Schlüsselverbindung her, die sich nach Deblockierung der Chloracetylfunktion in guter Ausbeute zum bisecting-Octasaccharid 90 umsetzen ließ. Die ebenfalls dargestellten phthalimido- oder succinimido-geschützten Analoga 86 und 85 erlaubten dies nicht, oder in nur geringen Ausbeuten. Mit Hilfe dieser neuen Synthesesequenz konnten erstmals zwei triantennäre (92 und 101) und eine tetraantennäre Struktur (102) mit bisecting-GlcNAc Rest auf chemischen Wege synthetisiert werden. Die triantennären bisecting-N-Glycane 92 und 101 konnten durch 2-D-NMR-Spektroskopie vollständig charakterisiert werden. Bei Verbindung 92 konnten neben der Trifluoracetamido-Schutzgruppe auch die Acetyl- und Phthalimido-Schutzgruppen in einem Schritt enfernt werden. Anhand des entschützten bisecting-Hexassaccharids 103 konnte gezeigt werden, daß die enzymatische Verlängerung des bisecting-GlcNAc durch Galactosyltransferase nur dann erfolgen kann, wenn kein alpha-1,6-Arm am N-Glycan vorhanden ist.

Untersuchungen zum Orientierungsverhalten von Zwei- und Dreiblockcopolymeren in oszillierenden Scherfelder (2002)

Stefan Stangler

Diese Arbeit beschäftigte sich mit dem Orientierungsverhalten von AB und ABC Blockcopolymeren unter Scherung. In Kapitel 1 wurden die Strukturbildung durch Mikrophasenseparation in Blockcopolymeren und deren makroskopische Orientierungs-verhalten erläutert. In Kapitel 2 wurde gezeigt, wie die in dieser Arbeit verwendeten Polymere durch lebende anionische Polymerisation synthetisiert und durch NMR, GPC und Membranosmometrie charakterisiert werden konnten. Kapitel 3 beschrieb Messmethoden zur Analyse der Struktur und der resultierenden Orientierung. Die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen zum Orientierungsverhalten von Blockcopolymeren zeigte Kapitel 4. Zwei weitere Messmethoden, FT-Rheologie und Rheooptik, wurden in Kapitel 5 vorgestellt. Mit diesen Methoden konnte auch in situ der Verlauf der Orientierung betrachtet werden. In Kapitel 6 wurden die Ergebnisse von fünf Blockcopolymersystemen vorgestellt und diskutiert. - S50I5020: Am lamellaren SI wurde gezeigt, dass das in dieser Arbeit verwendete SI-System gut geeignet ist, die Befunde anderer Gruppen zu bestätigen. Ebenfalls konnte so die Beherrschung der LAOS-Methode dokumentiert und der neue Messaufbau überprüft werden. Die Charakterisierung der resultierenden Orientierung mit 2D-SAXS und TEM wurde an einem Beispiel erläutert. Die Ergebnisse der Doppelbrechungsmessungen entsprechen größtenteils den in der Literatur zu findenden Daten. Abweichungen waren mit Hilfe geringfügiger Unterschiede in den Probenzusammensetzungen leicht zu erklären. - I45S45V1022: Lamellare ISV-Dreiblockcopolymere orientierten analog zu den Zweiblockcopolymeren bei kleinen Frequenzen und Scheramplituden senkrecht, während hohe Frequenzen und Scheramplituden zu paralleler Orientierung führten. Kinetikmessungen waren mit Doppelbrechung nicht reproduzierbar möglich, da durch die nicht löschbare Vororientierung jede Messung eine unterschiedliche Orientierungskinetik aufwies. Nur die resultierende Endorientierung konnte mit Hilfe von 2D-SAXS und Transmissionselektronenmikroskopie bestimmt werden. - S50I5020+DOP: Im Kapitel 6.3 wurde erläutert, dass verdünnte Systeme betrachtet wurden, um die TODT herabzusetzen. Die dynamisch-mechanischen Kenndaten wurden mit den Optikdaten der Doppelbrechung verglichen und diskutiert. LAOS-Experimente bei unterschiedlichen Scherfrequenzen und -amplituden wurden beschrieben, auf ihre Amplitudenabhängigkeit hin untersucht und mit den Literaturwerten verglichen. Das IS+DOP System wies in der Tendenz die gleiche Frequenz- und Amplitudenabhängigkeit des Orientierungsverlauf auf wie unverdünnte Zweiblockcopolymere. Kleine Frequenzen bzw. Amplituden führten zu senkrechter Orientierung („Regime 1“); höhere Frequenzen bzw. Amplituden führten zu paralleler Orientierung über eine zuvor ausgebildete senkrechte Orientierung („Regime 2“), und noch höhere Frequenzen bzw. Amplituden führten zu paralleler Orientierung über eine zuvor ausgebildete transversale Orientierung („Regime 3“). - I45S45V1022+DOP: Das ISV+DOP-System zeigte bei 80 °C eine OOT und war damit gut geeignet, die durch Probenpräparation erzeugte Vororientierung zu löschen. Bei Temperaturen von 60 und 70 °C liessen sich LAOS-Experimente durchführen, deren Optikdaten einen scheinbaren Verlauf der Orientierung nach „Regime 1 bis 3“ nahelegten. Erst die anschließende 2D-SAXS-Analyse zeigte, dass in Wahrheit mehrere Orientierungsspezies vorlagen. Unter allen hier gezeigten LAOS-Bedingungen war stets die parallele Orientierung die dominierende. Da hier keine uniaxiale Orientierung vorlag, konnte auch die Scheramplitudenabhängigkeit der Orientierungsgeschwindigkeit nicht mit der von Zweiblockcopolymeren in DOP verglichen werden. Auffällig war, dass der Orientierungsmechanismus über einen größeren Temperatur-, Frequenz- und Scheramplitudenbereich (verglichen mit dem verdünnten SI-System) gleich blieb. - S40I40M2025: Das Orientierungsverhalten der hier gezeigten nichtlamellaren Morphologie wich erheblich von dem der lamellaren Strukturen ab. Das Auftreten einer langen Induktionsphase und die Unabhängigkeit der resultierenden Endorientierung von Schertemperatur, Frequenz und Amplitude konnte gezeigt werden. Die Induktionsphase konnte durch das Wachstum der Domänen und durch ein Verbessern der Mikrophasenseparation und der damit eventuell verbundenen Morphologieänderung beschrieben werden. Die Charakterisierung der resultierenden Morphologie erfolgte mittels 2D-SAXS. Die Endorientierung bestand immer aus senkrecht orientierten Lamellen, die durch das Einlagern der PMMA-Zylinder in die niederviskose PI-Phase verbunden blieben. Da durch das „Verankern“ mit PMMA die Polystyrol-Phase nicht mehr über die PI-Schicht gleiten konnte, wurde die parallele Orientierung der Lamellen nicht mehr ausgebildet. Somit konnte gezeigt werden, dass Doppelbrechungsmessungen kombiniert mit 2D-SAXS und TEM gut geeignet sind, das Orientierungsverhalten von Blockcopolymersystemen zu charakterisieren. FT-Rheologie dagegen erwies sich als wenig hilfreich.

Development of Thermoplastic Elastomers with Improved Elastic Properties Based on Semicrystalline Block Copolymers (2002)

Holger Schmalz

In this work the synthesis and characterization of two novel types of thermoplastic elastomers (TPEs), exhibiting improved elastic properties compared to commercially available systems, is described. The first type comprises multiblock copoly(ether ester)s with semicrystalline hard segments and triblock copolymer soft segments. The second class of TPEs are systems based on ABA and ABC triblock copolymers with two glassy and one or two semicrystalline end blocks, respectively. The used strategy for increasing the elasticity of conventional copoly(ether ester)s based on poly(butylene terephthalate) (PBT) hard segments and polyether soft segments is the replacement of the continuous PBT hard phase in these systems by a disperse PBT hard phase. The incorporation of nonpolar segments is possible by using poly(ethylene oxide)-block-poly(ethylene-stat-butylene)-block-poly(ethylene oxide) (PEO-b-PEB-b-PEO) triblock copolymers, where the polar PEO blocks act as compatibilizer between the nonpolar PEB segments and the polar PBT segments during the melt polycondensation. The incorporated nonpolar PEB segments induce an enhanced microphase separation in the melt, which in turn results in the formation of a disperse PBT hard phase. Mechanical testing reveals a significantly improved elastic recovery compared to that of conventional copoly(ether ester)s exhibiting a continuous PBT hard phase. Morphological investigations reveal that this novel copoly(ether ester)s consist of a semicrystalline PBT hard phase and an amorphous soft segment phase, which is divided into a pure PEB phase, a PEO-rich phase besides a mixed PBT/PEO phase, and a pure amorphous PBT phase. The second part of this thesis deals with ABC triblock copolymers with one or two semicrystalline end blocks. Two main aspects were addressed: i) the interplay between morphology and crystallization, and ii) the comparison of ABA and ABC triblock copolymers with glassy (A), elastomeric (B) and crystalline (C) blocks. Several polyethylene-block-poly(ethylene-alt-propylene)-block-poly(ethylene oxide) (PE-b-PEP-b-PEO) triblock copolymers have been synthesized by sequential anionic polymerization of butadiene, isoprene, and ethylene oxide (PB-b-PI-b-PEO) followed by homogeneous catalytic hydrogenation. Anionic polymerization in a one-pot procedure was accomplished by using the phosphazene base t-BuP4, which enables the polymerization of ethylene oxide (EO) in the presence of Li+ counterions. Kinetic investigations on the EO polymerization reveal an unexpected induction period. It is concluded, that different factors contribute to the induction period, like break up of lithium alkoxide aggregates by t-BuP4, and chain length effects. Characterization of the PB-b-PI-b-PEO and PE-b-PEP-b-PEO triblock copolymers utilizing differential scanning calorimetry and special self-nucleation (SN) techniques reveals a strong influence of the confinement active during crystallization on the crystallization and SN behavior of the semicrystalline PEO and PE blocks. For low PEO contents large supercoolings are necessary to induce crystallization of PEO. Furthermore, the SN behavior of the PEO blocks is different compared to that of semicrystalline homopolymers, i. e. domain II (SN domain) is absent. This is a direct result of the confined crystallization of PEO within small isolated microdomains. In contrast, for the PE blocks a heterogeneous nucleation mechanism and the presence of all three SN domains, usually present in crystallizable homopolymers, is observed. In this case, PE crystallizes without any confinement from a homogeneous mixture of PE and PEP segments, which can be ascribed to their small segmental interaction parameter. In TPEs based on ABA triblock copolymers with two glassy end blocks, e. g. polystyrene-block-poly(ethylene-alt-propylene)-block-polystyrene (PS-b-PEP-b-PS), the middle block chains can either loop back into the same PS domain or form bridges between two different PS domains. However, only the bridges contribute to the elastic properties, which limits the elastic recovery of theses systems. The influence of a semicrystalline end block on the elastic properties has been investigated by comparison of PS-b-PEP-b-PE and the corresponding PS-b-PEP-b-PS triblock copolymers. For small elongations (< 300%) the PE containing triblock copolymers exhibit a significantly improved elastic recovery. This can be attributed to the increased bridge fraction induced by the immiscibility of the two different end blocks. In contrast, for high elongations (> 300%) the situation is reversed and the PS-b-PEP-b-PS triblock copolymers reveal better elastic properties. Obviously, glassy PS domains show a higher resistance against distortion compared to that of semicrystalline PE domains, especially at high strains.

DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors ABF1 aus S. cerevisiae: Spezifität und Kontaktpunkte (2002)

Rasa Beinoraviciute-Kellner

Das ABF1-Protein aus S. cerevisiae ist als ein multifunktioneller, dsDNA-bindender Transkriptionsfaktor bekannt, der nicht nur Transkriptionsprozesse in der Zelle reguliert, sondern auch an der DNA-Replikation und einer Nukleosomen-Rekonfiguration bzw. Änderung der Chromatinstruktur beteiligt ist. Da das Protein in verschiedenen Zusammenhängen immer wieder gefunden wurde, kann man davon ausgehen, dass es in den Zellprozessen eine essentielle Rolle spielt. Aus diesem Grund war es von besonderem Interesse, den zentralen Punkt der ABF1-Funktion – nämlich die Erkennung und Bindung des zugehörigen DNA-Elements – zu untersuchen und zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit wurden in vitro Experimente zur Klärung dieser Fragen verwendet, wobei ein besonderes Augenmerk auf der Identifizierung der Kontaktpunkte lag. Die Experimente stützen sich auf die Literaturdaten über das spezifische DNA-Erkennungsmotiv 5’-CGTNNNNRRYGAY (konservierte Nukleotide sind unterstrichen) sowie über die strukturellen Domänen von ABF1 (Zink-Finger-Motiv, Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH) und C-terminale Transaktivierungsdomäne). Mittels Gelretardationsexperimenten mit verschiedenen DNA-Sonden wurde gezeigt, dass ABF1 einen richtungsorientierten DNA-Bindungsmechanismus aufweist und eine Neigung zur Oligomerisierung besitzt. Die DNA-Bindungsaffinität ist stark von der Sondenlänge abhängig – die Verkürzung des DNA-Fragments von 27 auf 20 bp verringert die Bindung um eine Größenordung – , die Zusammensetzung des variablen Bereichs des Konsensusmotivs hingegen beeinflusst die Bindung nur geringfügig. Offenbar finden nur wenige ABF1-DNA-Kontakte im variablen Bereich statt, wie durch fehlgepaarte ARS1-Fragmenten nachgewiesen werden konnte. Um das ABF1-Erkennungsmotiv einzuschränken bzw. besser zu beschreiben, wurde ein in vitro DNA-Selektionsverfahren (SELEX) eingesetzt. Mit diesem Ansatz wurden zwei dsDNA-Aptamere identifiziert, die am häufigsten im selektierten DNA-Pool vorkommen und eine bis zu 20fach höhere DNA-Bindungsaffinität im Vergleich zu einem ARS1-Fragment aufweisen. Von den selektierten ABF1-Erkennungsmotive konnten die meisten im S. cerevisiae Genom wiedergefunden werden. Die Sequenzanalyse der selektierten Aptamere führte zur Erweiterung des Konsensusmotivs (5’-TACCGTATNNNATGATGT) im Vergleich zur bisher formulierten ABF1-Erkennungssequenz 5’-CGTNNNNRRYGAY. Mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie wurde die ABF1-DNA-Bindungsreaktion in Bezug auf Thermodynamik und Kinetik genauer charakterisiert. Anhand der im analysierten Temperatur- (10-35°C) und Salzkonzentrationsbereich (100-300 mM NaCl) gemessenen Geschwindigkeits- und Gleichgewichtskonstanten konnten auf die Bildung von 6-7 ionischen Kontakten bei der spezifischen ABF1-ARS1-Wechselwirkung geschlossen werden. Dabei ist die Dissoziationsgeschwindigkeit sehr stark von der Ionenstärke abhängig. Die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante kA dagegen ist nur wenig von den externen Bedingungen abhängig, zeigt aber – im Gegensatz zu kD – eine deutliche Sequenzspezifität. Aus der Temperaturabhängigkeit der thermodynamischen Parametern lässt sich schließen, dass die ABF1-DNA-Bindung bei physiologischen Temperaturen eine enthalpiekontrollierte Reaktion darstellt. In der ABF1-Struktur sind das Zink-Finger- sowie das HTH-Motiv als potenzielle DNA-Bindungsdomänen bekannt. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der DNA-Bindedomäne sowie die Identifizierung von den DNA-kontaktierenden Aminosäuren. Dafür wurde ein 27 bp langes, I5dU-substituiertes ARS1-Fragment mit ABF1 durch UV-Bestrahlung quervernetzt. Ein limitierter Trypsin-Verdau des Quervernetzungsprodukts sowie die Ergebnisse einer chemischen Spaltung mit NTCB und Hydroxylamin legten nahe, dass nur das Zink-Finger-Motiv eine Quervernetzung mit dem untersuchten ARS1-Fragment eingeht. Die vollständige Spaltung des Quervernetzungsproduktes mit Trypsin und PDE I/II lieferte ein Peptid-Nukleotid-Addukt, das mittels MALDI-MS charakterisiert wurde. Es gelang, das Peptid NSHR aus der Zink-Finger-Region zu identifizieren, das höchstwahrscheinlich über His57 einen spezifischen DNA-Kontakt mit dem IdU-Rest an Position 8 im ARS1-Oligonukleotid bildet. Damit ist die Beteiligung des Zn-Fingers des ABF1-Proteins an der DNA-Bindung eindeutig nachgewiesen.

Polarmodifikation von Butadienkautschuk mit Polyethylenglykol (2002)

Mabel Graf

Die Darstellung von polarmodifizierten Polybutadienen durch Reaktion von lebenden Polybutadienylanionen mit endfunktionalisierten Polyethylenglykolen (PEG) wurde untersucht. Hierzu wurden zwei unterschiedlichen Typen endfunktionalisierter Polyethylenglykole synthetisiert. Bei der Copolymersynthese waren Reaktionssystem und Reaktionsstrategie durch die gewünschte Anwendung bestimmt. Um in Kautschukmischungen für Reifen zur Verbesserung der Kautschuk-Füllstoff-Wechselwirkung eingesetzt werden zu können, sollten die Polybutadiene einen hohen Anteil an 1,4-Vernüpfungen haben. Die Modifikation mit den funktionalisierten PEG sollte mittels einfacher und kostengünstiger Reaktionen erfolgen. Zunächst wurde die Reaktion von PEG mit substituierbarer Endgruppe mit Polybutadienyl-lithium betrachtet. Dazu wurden PEG mit Chlor-, Iod- und Sulfonsäureester-Endgruppen eingesetzt. Letztere Endgruppen waren unter den gegebenen Bedingungen nicht für eine Polarmodifikation des PB geeignet. Mit den halogenfunktionalisierten Polyethylenglykolen wurden Kopplungsgrade von bis zu 50 % d. Th. erreicht. Auftretende Nebenprodukte konnten mittels Flüssigchromatographie unter kritischen Bedingungen (LACCC) und deren Kopplung mit der Größenausschlusschromatographie (GPC) analysiert und so der Reaktions-ablauf aufgeklärt werden. Die Einfachheit der Reaktion begründet ein industrielles Interesse, aufgrund des Reaktionsmechanismus ist jedoch eine vollständige Reaktion mit lebenden Polybutadienylanionen nicht möglich. Als Alternative wurde eine Kopplungsreaktion von Polybutadienyllithium mit PEG mit nicht homopolymerisierbarer Doppelbindung betrachtet. Hierfür wurden PEG mit 1,1-Diphenyl-ethylen- (DPE) und Benzophenon-Endgruppe hergestellt. Bei der Reaktion mit dem DPE-funktionalisierten Polyether wurden zahlreiche Nebenprodukte gefunden. Die Modifikation mit benzophenonfunktionalisierten PEG führte zu Produkten mit einem Polyetheranteil von bis zu 67 % d. Theorie. Auch bei dieser Reaktion wurden Nebenprodukte beobachtet, deren Bildung mittels LACCC/GPC aufgeklärt werden konnte. Durch Veränderung einiger Parameter kann dieser Reaktionstyp kontrollierbarer gemacht werden und kann so eine interessante Methode zur Darstellung von Blockcopolymeren oder verzweigten Polymeren aus Dienen und Polyethylenglykolen darstellen. Im Rahmen einer Industriekooperation wurden unter Verwendung chlorfunktionalisierter PEG mehrere modifizierte Polybutadiene in Mengen von je 500 g hergestellt. Diese wurden vom Kooperationspartner in reifentypischen Kautschukmischungen umgesetzt. Die mechanischen Eigenschaften dieser Mischungen und der daraus erhaltenen Vulkanisate wurden mit typischen Methoden bestimmt. Ein ausgeprägter Einfluss des eingebrachten PEG-Anteils auf die Eigenschaften der Vulkanisate konnte aufgrund der geringen Menge Polyethylenglykol bezogen auf die Gesamtmischung nicht festgestellt werden.

Di(imino)pyridin-Vanadium(III)komplexe als Katalysatoren für die homogene und heterogene Ethylenoligomerisation und -polymerisation (2002)

Stefan Gottfried

Es wurden neue Di(imino)pyridin-Vanadium(III)-Komplexe und deren Struktur-Wirkungs-Beziehung für den Einsatz als Katalysatorvorstufen in der homogenen und heterogenen Umsetzung mit Ethen untersucht. Weiterhin wurden durch Alkylsubstituenten derivatisierte Vertreter dieses Komplextyps mit entsprechenden Metallocenkomplexen hinsichtlich der veränderten Polymerisationseigenschaften verglichen. Zum Abschluss wurde mit der Untersuchung der Katalysatormischungen eine mögliche Anwendung für die synthetisierten Verbindungen aufgezeigt. Alle synthetisierten Komplexe wurden auf ihre katalytische Anwendung in der homogenen und zum Teil in der heterogenen Ethenpolymerisation getestet. Die Di(imino)pyridin-Liganden wurden durch Kondensationsreaktion aus Diacetyl-pyridin und einem entsprechend substituierten Anilin synthetisiert. Die Komplexe wurden aus den synthetisierten Liganden und dem THF-Addukt des Vanadiumtrichlorids. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Substituenten am Anilinring direkten Einfluss auf die katalytische Aktivität und die gebildeten Produkte bei der Umsetzung mit Ethen haben. Man beobachtet, je nach Substitution, sowohl die Bildung von Polymer, als auch die Bildung von niedermolekularen Oligomeren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Größe und Natur des Substituenten Einfluss auf die Polymerisationsaktivität haben. Es wurde versucht mit physikalischen (Druck, Temperatur) und chemischen (Zusätze) Methoden die Selektivität der Katalysatoren zu erhöhen. Die durch die vorgestellten Katalysatorsysteme erhaltenen Oligomermischungen ent-halten vorwiegend (>97 %) 1-Olefine welche nach der Trennung als Comonomere für die Herstellung von LLDPE eingesetzt werden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das Verhalten von Vanadiumkomplexen unter-sucht werden, die am Zentrallmetall substituiert sind. Diese Komplexe sollten mit analog substituierten Metallocenkomplexen verglichen werden. Der Vergleich der Aktivitäten der Vanadiumkomplexe zeigt, dass eine Umsetzung dieser Komplexe mit Benzylmagnesiumchlorid und Ethylmagnesiumchlorid immer zu einem Aktivitäts-verlust führt. Ein Vergleich der Oligomer-produkte dieser Reihe zeigt, dass keine großen Unterschiede innerhalb der Oligo-merverteilung vorliegen. Die anderen Vanadiumkomplexe weisen ebenfalls einen steigenden Aktivitätsverlust bei zunehmender Alkylierung auf. Umgekehrt verhält es sich bei den Metallocenkomplexen mit Alkylliganden. Eine zu-nehmende Alkylierung mit Benzylmagnesiumchlorid, Allylmagnesiumchlorid und Ethylmagnesiumchlorid führt zu einem Anwachsen der Aktivitäten. Der Kristallinitätsgrad wies fast alle Polymere der Vanadiumkomplexe als HDPE aus, wobei die Werte teilweise in den Grenzbereich von HDPE verschoben waren. Die untersuchten Polymere der Metallocenkomplexe sind durch den deutlich niedrigeren Kristallinitätsgrad als LDPE gekennzeichnet. Im dritten Teil sollte die Einsatzmöglichkeit eines Vanadium-Oligomerisierungs-katalysators in Kombination mit einem Metallocenkatalysators getestet werden. Es wurden verschiedenen Mischungsverhältnisse hergestellt und zur Polymerisation von Ethen verwendet. Die Untersuchungen der erhaltenen Polymere erwiesen sich dabei als sehr vielversprechend. Es konnte gezeigt werden, dass sich Kenngrössen wie Schmelzpunkt und Schmelzenthalpie im Vergleich zum Polyethylen, das mit reinem Metallocenkatalysator hergestellt wurde, merklich geändert haben. Des weiteren konnten durch Untersuchungen der Materialeigenschaften des Polymers sowie rheologische Untersuchungen Veränderungen im Verhalten der Polymere beobachtet werden. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass eine "in-situ" Co-polymerisation stattgefunden hat. Es konnte somit eine interessante Anwendungs-möglichkeit für die vorgestellten Vanadiumkatalysatoren gezeigt werden. Die große Vielfalt der Kombinationsmöglichkeiten legt gerade auf diesem Gebiet weitergehende Untersuchungen nahe.

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