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Isolierung, Strukturaufklärung und Totalsynthese von Alkaloiden aus Stenus Käfern und der Seeanemone Heteractis aurora (2011)

Tobias Müller

Die neuen Pyridinalkaloide (Z)- und (E)-3-(2-Methyl-1-butenyl)-pyridin konnten jeweils in den Pygidialdrüsen der Kurzflügelkäfer Stenus solutus und S. similis als Hauptkomponenten nachgewiesen werden. Die Norverbindung 3-(1-Isobutenyl)-pyridin wurde als Minderkomponente in S. solutus, S. cicindeloides, S. binotatus und S. pubescens gefunden. Die Strukturen wurden durch NMR-Spektroskopie und Vergleich mit synthetischen Referenzen aufgeklärt. Die Pyridine wurden durch Umsetzung von Nicotinaldehyd mit dem jeweiligen Phosphoniumsalz nach WITTIG in einer Stufe erhalten. Für das bekannte Spreitungs- und Abwehralkaloid Stenusin, welches in den meisten Käfern der Gattung Stenus vorkommt, wurde eine neuartige Syntheseroute entwickelt. Die Stenusin enthaltenden Steninae zeigen eine charakteristische Zusammensetzung aller vier Stereoisomeren. Alle bislang bekannten stereoselektiven Zugänge zu Stenusin, wie auch die auf der SAMP/RAMP-Methode basierende Varinate nach ENDERS et al., erlauben nur die Darstellung der in der Seitenkette (S)-konfigurierten Alkaloide (2S,3R)- und (2S,3S)-Stenusin. Daher wurde eine neue Synthese entwickelt, die es erlaubt, alle Isomere selektiv darzustellen. Das Stereozentrum im Piperidinring wird durch auxiliarvermittelte asymmetrische Hydrierung erzeugt, während die Seitenkette entweder aus dem chiralen Pool ((S)-2-Methylbutanol) entnommen wird – identisch mit der Variante nach ENDERS – oder mittels einer chemoenzymatischen Synthese erzeugt wird. Insbesondere die (2S,3R)- und (2S,3S)-Isomere lassen sich ausgehend von 3-Brompyridin und (S)-2-Methylbutylbromid in einer sehr kurzen Sequenz von nur 4 Stufen in guter Ausbeute darstellen. Weiterhin erfolgt die gesamte Synthese frei von Schutzgruppen. Das verwendete EVANS-Auxiliar kann nach der Hydrierung unverändert wiedergewonnen werden. Das neue Alkaloid Cicindeloin wurde aus Stenus-Käfern der Art S. cicindeloides isoliert und dessen Struktur durch NMR-Spektroskopie in Verbindung mit EI- und ESI-Massenspektroskopie aufgeklärt. Die Absolutkonfiguration von Cicindeloin konnte durch stereoselektive Totalsynthese und GC-Vergleich mit dem Naturstoff an einer chiralen Phase bestimmt werden. Es wurde ein totalsynthetischer Zugang mit 20% Gesamt¬ausbeute entwickelt, der eine lineare Sequenz von 12 Stufen umfasst, von denen neun ohne Chromatographie auskommen.

Die Regulation der prokaryontischen Transkription auf molekularer Ebene (2008)

Stefan Josef Prasch

In Escherichia coli wird die RNA-Synthese durch eine aus fünf Untereinheiten bestehende RNA Polymerase (RNAP) katalysiert. Für die Bildung der Phosphodiesterbindung in der RNA sind die beta- und beta’-Untereinheiten verantwortlich. Die aminoterminalen Domänen der beiden alpha-Untereinheiten sind für den korrekten Aufbau zuständig, während die durch einen flexiblen Linker verbundenen carboxyterminalen Domänen (alphaCTD) regulatorische Aufgaben erfüllen. Die zuletzt entdeckte omega-Untereinheit fördert ebenso den Aufbau, ist aber für das Überleben von Escherichia coli nicht notwendig. Der Ablauf der Transkription wird begrifflich in die Initiation, Elongation und Termination eingeteilt. Bei der Initiation bindet ein so genannter sigma-Faktor an die RNAP. Das so entstandene Holoenzym erkennt den Promotor und startet die RNA-Synthese. Der sigma-Faktor verlässt die RNAP, es bildet sich der Transkriptionselongationskomplex, der zu einer stark gesteigerten RNA-Syntheserate führt. Im letzten Schritt erfolgt der Kettenabbruch, woraufhin freigewordene RNAP erneut einen Transkriptionszyklus starten kann. Eine zentrale Rolle bei der Regulation der Elongation und Termination spielt das essentielle NusA Protein (N utilization substance A), das im Verbund mit NusB, NusE und NusG, vor allem die Geschwindigkeit der RNA-Synthese steuert. Der Aufbau von NusA aus sechs Domänen spiegelt die vielfältigen Aufgaben des Proteins. Die aminoterminale Domäne vermittelt die Interaktion mit der RNAP. Die RNA-Bindungsregion wird durch die S1-, KH1- und KH2-Domänen aufgebaut. Die beiden carboxyterminalen acidic repeats AR1 und AR2 erfüllen jeweils unterschiedliche Aufgaben, die bisher nur zum Teil aufgeklärt sind und im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Eine weitere Rolle spielt NusA bei der Antitermination. Dieser zuerst im Phagen lambda entdeckte Mechanismus bewirkt, dass die Transkription nicht an einem Terminationssignal abbricht. Das dafür notwendige Antiterminationssignal besteht aus zwei bestimmten RNA-Sequenzabschnitten, boxA und boxB, die durch eine Trennsequenz miteinander verbunden sind. Während die boxA sowohl im Phagen lambda als auch in den für die ribosomale RNA codierenden Operons stark konserviert ist, weist die boxB in den beiden genannten Fällen nur geringe Gemeinsamkeiten auf. Das NusA Protein bindet an das Antiterminationssignal und an die RNAP. Die so veränderte RNAP ist nun in der Lage, stromabwärts gelegene Terminationssignale zu überlesen. In dieser Arbeit wurde zuerst die Rolle der AR1 Domäne untersucht. Eine bereits bekannte Kristallstruktur zeigt AR1 in Komplex mit lambda N. Jedoch fehlt in dieser Struktur die zweite Hälfte des lambda N Bindungsmotives (Aminosäurereste 42 bis 47), ebenso wie AR2, was zur Vermutung führte, dass diese Domäne lambda N(42-47) binden könne. Zur Klärung dieser Frage wurden die beiden Domänen AR1 und AR2 jeweils einzeln kloniert und im Hinblick auf ihre Bindung an das lambda N Protein getestet. In dieser Arbeit wurde eine ausschließliche Bindung von AR1 an lambda N gefunden, inklusive der in der Kristallstruktur fehlenden Aminosäurereste. Zusätzlich induziert AR1 bei der Bindung eine helikale Konformation im Bereich des Arginin-reichen Motives von lambda N (Aminosäurereste 1 bis 22), wodurch ein theoretisches Modell der lambda N Funktionsweise bestätigt wurde. Zudem wurde die Interaktion von NusA-AR2 charakterisiert. Biochemische Daten ließen auf eine Wechselwirkung von NusA mit alphaCTD schließen. Basierend darauf wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass in diesem Fall ausschließlich AR2 für die Wechselwirkung mit alphaCTD verantwortlich ist. Mit Hilfe von NMR-Experimenten wurde im Anschluss daran die Komplexstruktur berechnet. Die resultierende Bindungsfläche seitens alphaCTD lieferte dabei Rückschlüsse, wie NusA möglicherweise die RNAP von der Initiations- in die Elongationsphase überführt. Ebenso erlaubten die neu gewonnenen Ergebnisse einen Vergleich der Bindungseigenschaften von AR1 und AR2. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Wechselwirkung von NusA mit dem Antiterminationssignal studiert. Dazu wurde eine NusA Deletionsmutante kloniert und gereinigt, die ausschließlich aus den bisher vermuteten RNA-Bindungsdomänen S1, KH1 und KH2 bestand. Anhand der gemessenen Fluoreszenzanisotropie-Daten wurde die Bindung im Bereich der Trennsequenz lokalisiert. Die schwächere Affinität des Phagen lambda Signals nutL und nutR im Vergleich zur ribosomalen RNA erklärt die Notwendigkeit des zusätzlichen Faktors lambda N im Phagen System.

Synthese, Charakterisierung und Materialeigenschaften borreicher Boride und Boridcarbide des Magnesiums und Aluminiums (2005)

Volker Adasch

Hauptziel der Arbeit war die Synthese und Charakterisierung neuer borreicher Boride und Boridcarbide des Magnesiums. Es konnten Einkristalle von MgB7, MgB12, MgB17, B12MgC2 (orthorhombisch), B24Mg2C, B12MgC2 (monoklin) und B50Mg3C8 erhalten und durch RSA sowie WDX charakterisiert werden. Alle Synthesen fanden aus den Elementen statt. Entsprechend theoretischer Phasendiagramme erfordert die Synthese borreicher Boride und Boridcarbide des Magnesiums hohe Reaktionstemperaturen und niedrige Mg-Dampfdrücke. Speziell Reaktionstemperaturen oberhalb des Siedepunkts von Mg sind in offenen Reaktionsgefäßen nicht sinnvoll zu realisieren. Daher wurden die Synthesen in geschlossenen Gefäßen (aus h-BN) durchgeführt. Um während der Synthesen sowohl ein Bersten der h-BN-Tiegel als auch Mg-Verluste durch Diffusion zu vermeiden, wurden die h-BN-Tiegel wiederum in verschließbare Ta-Ampullen eingeführt. Die doppelte Wandung aus h-BN und Ta wurde gewählt, da ausgeschlossen werden sollte, dass B mit Ta Tantalboride bildet. Zur Realisierung eines niedrigen Mg-Dampfdrucks innerhalb des Reaktionsgefäßes wurden die Synthesen in Anlehnung an das Raoultsche Gesetz in Hilfsmetallbadschmelzen durchgeführt. Als Hilfsmetalle kamen Kupfer und Aluminium zur Anwendung. Speziell Kupfer erwies sich als optimales Hilfsmetall. In MgB7 und B12MgC2 (orthorhombisch) liegen B12-Ikosaeder vor, die eine hexagonal primitive Packung bilden. In MgB7 werden die trigonal prismatischen Lücken dieser Packung alternierend mit einem Mg-Atom und mit zwei B-Atomen besetzt. Zusätzlich befindet sich eine Mg-Lage auf einer gemeinsamen Vierecksflächen zweier trigonaler Prismen. In B12MgC2 (orthorhombisch) erfolgt die Besetzung der trigonal prismatischen Lücken alternierend mit einem Mg-Atom und mit zwei C-Atomen. Weitere interstitielle Lagen gibt es hier nicht. In MgB12 bilden B12-Ikosaeder 3.6.3.6.-Ikosaeder-Kagomè-Netze, die in der Schichtenfolge ABA angeordnet sind. Zwischen den Schichten befinden sich B12-Ikosaeder und B21-Einheiten. Alle Bor-Cluster sind miteinander zu einem dreidimensionalen Netzwerk verbunden, in dessen Hohlräumen sich Mg befindet. Die B21-Einheit besteht aus einem B12-Ikosaeder, einem B11-Fragment und einem einzelnen Bor-Atom. Das B12-Ikosaeder ist mit der B11-Einheit über eine gemeinsame Dreiecksfläche verbunden. Dieses B21-Cluster wurde im Bereich der Stoffklasse der borreichen Boride bislang noch nicht beobachtet. Das Elektronendefizit der B21-Einheit wurde über die sogenannte mnopq-Regel bestimmt und beträgt vier Elektronen. MgB17 ist eine Auffüllungsvariante des beta-rhomboedrischen Bors. Die Mg4-Position in MgB17 wurde bislang noch in keiner anderen Auffüllungsvariante besetzt. Das Mg3-Atom substituiert teilweise ein B-Atom der B28-Einheit. B24Mg2C ist die erste stöchiometrische Auffüllungsvariante des tetragonalen Bor (1). Die Basistruktur beider Verbindungen ist eine tetragonal innenzentrierte Stabpackung von B12-Ikosaedern. In B24Mg2C befinden sich zwischen den Stäben zwei Arten von Kanälen. In der einen Hälfte der Kanäle werden alle Tetraederlücken besetzt, wobei Mg und C alternieren. Im anderen Typ von Kanälen können Oktaederlücken definiert werden, hierbei ist jede zweite Oktaederlücke mit Mg gefüllt. Das strukturbestimmende Merkmal von B12MgC2 (monoklin) sind B12-Ikosaeder, die in einer verzerrten kubisch dichtesten Packung angeordnet sind. Die Tetraederlücken dieser Packung werden mit C, die Oktaederlücken mit Mg besetzt. B12MgC2 (monoklin) ist an Luft bis etwa 600 °C stabil, die Vickers-Härte liegt im Mittel bei 29,9 GPa. In B50Mg3C8 liegen B12-Ikosaeder vor, die in hexagonalen Schichten angeordnet sind. Die Schichten sind nach der Folge AABBCC gestapelt. Zwischen den Schichten ungleicher Orientierung befinden sich lineare C-B-C-Einheiten. Zwischen den deckungsgleich angeordneten Schichten sind C2-Einheiten und Mg-Atome positioniert. Im Rahmen der Arbeit wurden außerdem die Bruchspannungen von Einkristallen von c-BN und B48Al3C2 bei statischer uniaxialer äußerer Krafteinwirkung bestimmt. Die Bruchspannung eines Einkristalls ist dabei eine Funktion der Kristallgröße und -form, der Härte (bzw. der Kristallstruktur), der kristallographischen Orientierung zur äußeren Kraft und der Art und Anzahl von Kristalldefekten, speziell von Versetzungen. Ziel war es die Mittelwerte der kritischen Spannungen von c-BN und B48Al3C2 sinnvoll in Relation zueinander zu setzen bzw. nur als Funktion der entsprechenden Kristallstrukturen und -defekte zu begreifen. Dazu wurde der Einfluss der Kristallgröße und -form auf die kritische Spannung über verschiedene Verfahrensschritte normiert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Mittelwert der kritischen Spannung von c-BN um den Faktor 1,88 größer ist als der von B48Al3C2.

Montmorillonit K10 als Trägermaterial in der metallocenkatalysierten Olefinpolymerisation; Strukturanalyse des Schichtsilicats und Katalysatorsystems, Charakterisierung der Nanocomposite (2005)

Christine Wirth

Heterogene Katalysatorsysteme mit Triisobutylaluminium-modifiziertem Montmorillonit K10 und Zirconocen- und Titanocenkomplexen wurden im Arbeitskreis Weiss äußerst effizient in der Ethylen- und Propylenpolymerisation eingesetzt. Mit der Zielsetzung Zusammenhänge zwischen Struktur und Trägeraktivität des säureaktivierten Schichtsilicats aufzuzeigen wurde eine Strukturcharakterisierung mittels der analytischen Methoden TG/DTA-MS, REM, TEM, Pulverdiffraktometrie, N2-Physisorption, FTIR und 29Si-, 27Al-, 1H- MAS-NMR-Spektroskopie durchgeführt. Anhand des Vergleichs mit dem unbehandelten Rohmaterial Montmorillonit wird dargelegt, dass durch die Säureaktivierung Kristallite entstehen, welche in der Mitte eine noch intakte Dreischichtstruktur, an den Rändern durch die Auflösung der Oktaederschicht amorphe kieselsäureähnliche Bereiche aufweisen. Dadurch resultieren im K10 Veränderungen physikalischer Eigenschaften wie eine Erhöhung um das 1,3-fache der spezifischen Oberfläche (200m2/g) sowie des Porenvolumens (0,33ml/g). Durch die Säurebehandlung wird eine deutlich breitere Porengrößenverteilung erhalten, wobei sowohl größere Keilporen durch osmotische Quellung der protonierten Zwischenschicht als auch kleinere Meso- bis Mikroporen innerhalb der ungeordneten Tetraederschicht-Randbereiche entstehen. Mit den gebildeten hydratisierten Silicatbereichen sowie dem H+-Austausch im Zwischenschichtraum ergeben sich neue chemische Umgebungen, welche im K10 als dreidimensionales Silicatnetzwerk (Q4, 29Si-MAS-NMR), als Defekt-Silanolgruppen (FTIR; 29Si, 1H) sowie in Form einer erhöhten Acidität (saure H+, 1H) detektiert werden. Die Untersuchungen am TIBA-modifizierten K10 (ICP-AES, TG/DTA-MS, Pulverdiffraktometrie, N2-Physisorption, FTIR, 29Si-, 27Al-, 1H- MAS-NMR) weisen einerseits Aluminium und Alkylgruppen nach und zeigen andererseits die aufgefächerten Silicatschicht-Randzonen als Reaktionsort an. Das Verschwinden der für isolierte SiOH-Gruppen charakteristischen IR-Bande im TIBA-behandelten K10 sowie ein zusätzliches, dem struktureigenen oktaedrischen und tetraedrischen Aluminium gleichgestelltes Aluminiumsignal belegen die chemische Anbindung des Aluminiumalkyls an die Oberfläche des Schichtsilicats. Eine Oligomer- bzw. Kettenbildung ist nicht auszuschließen. Das heterogene Katalysatorsystem aus K10/TIBA und den Metallocenen Cp2ZrCl2 oder rac-EtInd2ZrCl2 generiert das aktive Metallocenkation, welches sowohl Ethylen- als auch Propylen mit guten Aktivitäten polymerisiert. Das Trägermaterial K10 wurde unterschiedlicher thermischer Vorbehandlung sowie Kationenaustauschreaktionen unterzogen und anschließend in der Ethylenpolymerisation getestet. Dabei stellt sich eine Abhängigkeit der Polymerisationsaktivität vom Hydrationszustand des Trägermaterials sowie von der chemischen Beschaffenheit des Zwischenschichtraumes heraus. Ungetrockneter Montmorillonit K10 weist die höchste Aktivität auf, durch Trocknung kollabierte Schichten im K10 bedingen eine Abnahme der Aktivität, Calcinierung bei hohen Temperaturen führt zu drastischem Aktivitätsverlust. Nach Kationenaustauschreaktion mit Ba2+-Ionen bleibt die Trägeraktivität des K10 erhalten. Der Austausch der Zwischenschichtkationen mit Cs+-Kationen führt zur Verdrängung des Zwischenschichtwassers und infolgedessen zu kollabierten Schichten. Mit Alkylammoniumionen ((CH3)4N+, (CH3)3N+C16H33) organophilierter Montmorillonit K10 (Org+-K10) weist neben der Einlagerung in die Zwischenschicht Oberflächenbelegung durch die organischen Moleküle auf. Sowohl Cs+- als auch Org+-K10 sind als Trägermaterial inaktiv in der Ethylenpolymerisation. Bei den in situ katalysierten Polymeren handelt es sich um Nanocomposite (NCs) mit 3-11% Schichtsilicatanteil. Die für Nanocomposite wesentlichen Strukturmerkmale und Eigenschaften (Verteilung des Füllstoffs im Polymer, mechanische Eigenschaften) wurden mittels Pulverdiffraktometrie, TEM und Zugprüfungsmessungen untersucht. Es kann eine sehr gute Anbindung der Polyethylen- sowie Polypropylenmatrix an den ungeordnet interkalierten bis partiell exfolierten Montmorillonit nachgewiesen werden. Diese starke Füllstoff-Polymer-Wechselwirkung führt zu herausragend guten mechanischen Eigenschaften im Rahmen der Zugprüfung. Die K10-PE-Nanocomposite zeigen im Vergleich zum homogen katalysierten PE ohne Schichtsilicatanteil eine immer noch hohe Reißdehnung und eine drastische Erhöhung der Reißfestigkeit. Dabei wird der höchste Wert (45MPa), welcher Literaturwerte sowohl vergleichbarer schmelzinterkalierter NCs als auch in situ hergestellter PE-NCs übersteigt, bei Einsatz von gesichtetem Montmorillonit K10 mit enger Partikelgrößenverteilung erzielt. Die gute Adhäsion an das Polymer belegt die starke chemische Bindung des Metallocens an die Oberfläche des TIBA-modifizierten Montmorillonits im eingesetzten heterogenen Katalysatorsystems.

Regulation der Transkription: Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen der carboxyterminalen Domäne von E.coli NusA (2005)

Anke Eisenmann

Die RNA-Synthese in der Zelle wird durch RNA Polymerasen (RNAPs) katalysiert und erfolgt in einem Zyklus aus Initiation, Elongation und Termination. In den letzten Jahren konnten durch die Aufklärung von Kristallstrukturen elongierender RNAPs vor allem Fortschritte im Verständnis der Elongationsphase erzielt werden, so daß die Elongation derzeit ein attraktives Forschungsgebiet darstellt. Während der Elongation bildet die RNAP einen stabilen Komplex mit DNA und RNA, der als Transkriptionselongationskomplex (TEC) bezeichnet wird, und über Tausende von Basenpaaren prozessiv ist, das heißt nicht dissoziiert. Lediglich an bestimmten DNA-Elementen, sogenannten Terminatoren, kann der TEC soweit destabilisiert werden, daß die Transkription beendet werden kann. Die Effizienz der Termination wird dabei durch Transkriptionsfaktoren reguliert. In E.coli wird die Entscheidung Elongation-versus-Termination an einem Terminator durch den allgemeinen Transkriptionsfaktor NusA beeinflußt. NusA assoziiert während der Elongation mit dem TEC und fördert sowohl Pausen während der Transkription als auch die Termination. Dagegen wirkt NusA zusammen mit dem viralen Antiterminator-Protein lambda N selbst als Antiterminator und setzt die Terminationseffizienz herab. Sequenzvergleiche zwischen verschiedenen bakteriellen NusA-Proteinen sowie biochemische Daten weisen darauf hin, daß NusA aus drei funktionellen Domänen besteht. Dabei wechselwirkt die aminoterminale Domäne mit den großen Untereinheiten der RNAP während die zentrale Domäne RNA-Interaktionen vermittelt. Die ungefähr 160 Aminosäuren umfassende carboxyterminale Domäne, NusACTD, ist nur in einigen NusA-Proteinen vorhanden. NusACTD ist auffallend negativ geladen und enthält eine Sequenzwiederholung. Für den konservierten aminoterminalen und zentralen Bereich von NusA wurden die Strukturen von T.maritima und M.tuberculosis mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Eine hochaufgelöste Struktur für NusACTD konnte dagegen erst in dieser Arbeit mit NMR-Spektroskopie gewonnen werden. NusACTD besteht aus zwei strukturell ähnlichen Domänen NusA(353-416) (AR1)und NusA(431-490) (AR2), die ungefähr den zwei homologen sauren Sequenzbereichen entsprechen. Mit 15N-Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, daß die Domänen über eine flexible Linkerregion verbunden sind und keine definierte Orientierung zueinander einnehmen. Jede der Domänen weist fünf Helices auf, die eine (HhH)2-Faltung annehmen. Charakteristisch für die (HhH)2-Faltung sind jeweils zwei gegeneinander gepackte HhH-Motive, die zusammen mit der Verbindungshelix zwischen den Motiven einen kompakten hydrophoben Kern bilden. (HhH)2-Faltungen kommen häufig als selbständige Domänen vor, die DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln. E.coli NusACTD wechselwirkt mit dem viralen lambda N-Protein sowie der carboxyterminalen Domäne der alpha Untereinheit der RNAP (alpha CTD). Zudem reguliert NusACTD die RNA-Bindung an die zentrale Domäne von NusA, indem es selbst mit den RNA-Bindungsstellen interagiert. Trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeit erkennen AR1 und AR2 lambda N und alpha CTD auf unterschiedliche Art und Weise. In dieser Arbeit durchgeführte Titrationsexperimente weisen darauf hin, daß alpha CTD ausschließlich an AR2 bindet, während lambda N wahrscheinlich nur mit AR1 spezifische Kontakte ausbildet. Die Wechselwirkung von alpha CTD mit NusA ermöglicht in vitro eine RNA-Bindung an NusA. Es ist daher anzunehmen, daß AR2 eine autoinhibitorische Funktion besitzt. Zusätzlich scheinen die Wechselwirkungen von NusACTD und alpha CTD zur Stabilisierung der RNAP-NusA-Interaktion beizutragen. Die antiterminatorische Wirkung von lambda N beruht auf einer direkten Interaktion zwischen der RNAP und einer Region von lambda N außerhalb der NusA-Bindungsregion. Die lambda N-NusA-Wechselwirkung steigert die Antiterminationseffizienz von NusA wahrscheinlich über eine Stabilisierung der schwachen RNAP-lambda N-Interaktion. Der Vergleich der Struktur von AR1 im ungebundenen Zustand mit der kürzlich gelösten Röntgenkristallstruktur des NusA(350-424)-lambda N(34-47)-Komplexes unterstützt die Hypothese, daß die NusA-lambda N-Wechselwirkung nicht direkt am Mechanismus der Antitermination beteiligt ist, da nur geringe konformationelle Änderungen durch die Komplexbildung beobachtet werden. Insgesamt stellt NusACTD über seine beiden (HhH)2-Module eine vielseitige Interaktionsfläche bereit, die möglicherweise Bindungsstellen für weitere Proteine neben alpha CTD und lambda N bietet. Die Trennung der Domänen über eine mobile Linkerregion ermöglicht eine Anpassung an konformationelle Veränderungen in der TEC-Struktur, die zum Beispiel beim Übergang des TEC von einem Elongations- in einen Antiterminationszustand auftreten können. Die flexible Verbindung zwischen den Domänen ist zudem für den Mechanismus der Autoinhibition wichtig, da bei der Bindung von NusA an den TEC die RNA Zugang zu den Bindungsstellen erhält.

Structural Analysis of Cylindrical Particles by Small Angle X-ray Scattering (2005)

Li Li

The objective of this work is to analyze nano-scaled cylindrical particles by small angle X-ray scattering (SAXS). Three systems with cylinder-shaped particles: (1) Laponite particles in aqueous solutions, (2) Poly(carbon suboxide) particles in binary water/DMF solutions, and (3) Suprastructural aggregates of coil-ring-coil block copolymers in cyclohexane, have been studied by SAXS performing either a Kratky-Compact-Camera in our laboratory or ID2 beamline of the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble. The synthetic clay particles, Laponite RD, have been chosen as ideal disc-shaped model particles. In combination of SAXS with static light scattering, the scattering intensities of a concentration serial (volume fraction from 0.0002 to 0.0016) were measured in almost three orders of magnitude of the scattering vector q. Through extrapolation of concentration the scattering intensity at vanishing concentration, i.e. the form factor P(q) of particles was achieved. It shows q-2 decay at intermediate q range, which indicates that the shape of single Laponite particle in aqueous solution is platelet. The plateau of the form factor at low q range implies that there is no aggregate or cluster structure, and the Laponite particles are dispersed completely under the investigated conditions. More detailed structural information was then obtained by fitting of P(q) with disc model. The radii of the discs exhibit a large polydispersity. A radius of 10.5 nm with Schulz-Zimm distribution of Rw/Rn = 1.5 (where Rw and Rn denote weight and number average radius, respectively) was found to fit the form factor perfectly. The thickness of one single platelet was determined to be 0.9 nm. The weight averaged molecular weight and radius of gyration were determined to be 930 kg/mol and 13.4 nm, respectively. The inter-particle interactions of Laponite particles were investigated by the structure factor S(q), from which the effective diameter of interparticle interactions deff was determined for the first time. The strong electrostatic Coulomb repulsion between charged Laponite particles was attributed to the much higher value of deff (= 46 nm), in comparison to 2Rg (= 27 nm). The recently developed multicomponent interaction site model was performed by Harnau to predict these experimental structure factors. An effective potential of interaction, which pays attention to a screened Coulomb interaction as well as an attractive interaction, leads to the best description of the model to the experimental data. By means of SAXS, the size of synthetic polymer carbon suboxide ((C3O2)n) dissolved in binary water/DMF solutions was determined for the first time with radius of gyration Rg = 1.7 nm and molecular weight Mw = 2760 g/mol, which corresponds to a polymerization’s degree of about 40. This value is much larger than literature one (5-10). The form factor of polymer carbon suboxide can be described by a semiflexible chain model. The radius of gyration in cross-section RC and molecular weight per unit length ML were obtained to be 0.3 nm and 350 g/(mol.nm), respectively, which can confirm the fact that the chemical structure of poly(carbon suboxide) is repeated pyronic ring, as suggested in most literatures. Thus the structure and size of polymer carbon suboxide were characterized completely by SAXS. Finally, SAXS was employed to analyze a suprastructural aggregation system derived by self-assembly of coil-ring-coil block copolymers. This is a newly synthesized subclass of rod-coil block copolymers composed of a nanometer-sized shape-persistent macrocycle and two covalently attached polystyrene (PS) coils. The solubility of the rigid ring is largely enhanced due to the attachment of the flexible side groups. With suitable length of the flexible side groups (Mw (PS) = 2500 g/mol) the block copolymers can form colloidal-sized aggregates in selected solvent cyclohexane, which were concluded to be of cylindrical shape with the rigid rings packing densely in a tubular way and the flexible side groups arranging outside of the ring. Such aggregated cylinder brushes can be further confirmed to exist as a mixture of cylinder bundles by analyzing the local structural parameter ML (= 25730 g/(mol.nm), molecular weight per nm length of cylindrical objects). In comparison of this value with M0 (= 6500 g/mol, molecular weight of single coil-ring-coil block copolymer) and d (= 0.6 nm, distance of adjacent densely packed rings), the number fraction of coexisted single cylinder, bi- and tri-cylinder bundles was resulted to be 1:1:2. Through fitting by using approximated circular cylinder model the radius of single cylinders was determined to be 2.6 nm (polydispersity 20 percent) with a hollow inside of radius of 1.2 nm.

Bestimmung der Struktur der 15. Domäne des Multidomäneninhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie und Design einer inhibitorisch wirksamen Mutante (2004)

Klaus Vitzithum

In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur der 15. Domäne des Multidomänen-Inhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie bestimmt, sowie die inhibitorischen Eigenschaften dieser Domäne untersucht. Das Vorläuferprotein LEKTI (lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor) umfasst fünfzehn Domänen, von denen die 2. und 15. Domäne zwar ein typisches Kazalmotiv zeigen, jedoch anstatt der für klassische Kazalvertreter üblichen sechs 12-13 Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen aufweisen. Bei der schweren autosomal rezessiven Erbkrankheit Netherton Syndrom werden Mutationen im LEKTI-Gen gefunden, die eine vorzeitige Termination der Translation verursachen und daher nur zu verkürzt gebildetem LEKTI-Protein führen. Da die LEKTI-Domäne 15 bei Patienten mit Netherton Syndrom nicht exprimiert wird, ist diese besonders interessant. Einige Symptome des Netherton Syndroms legen eine Fehlregulierung der Proteinase Tryptase nahe, da diese eine Schlüsselrolle bei Überempfindlichkeitsreaktionen und Asthma einnimmt. Bei einem Sequenzvergleich des bislang einzig bekannten natürlich vorkommenden Tryptase-Inhibitors LDTI (leech derived tryptase inhibitor) mit den LEKTI-Domänen wurde eine signifikante Homologie zwischen Domäne 15 und LDTI insbesondere im Bereich der Bindungsschleife gefunden, weswegen eine regulatorische Funktion von LEKTI gegenüber Tryptase vermutet wird. Nachdem kein natürliches Material zur Verfügung stand, war es zur Gewinnung ausreichender Mengen rekombinanten Proteins, wie es für die Bestimmung der Struktur und der inhibitorischen Wirkung erforderlich ist, notwendig, ein geeignetes Expressions- und Reinigungssystem zu entwickeln. Obwohl es inzwischen einige Hinweise auf eine mögliche Prozessierung von LEKTI gibt, ist die natürliche Proteinsequenz der Domäne 15 noch nicht bekannt. Nach Vergleichen mit Kazalvertretern wurde ein 76 Aminosäuren großes Protein (dom15) hergestellt. Wie die strukturelle Charakterisierung ergab, ist dessen COOH-terminaler Abschnitt nicht strukturiert, weswegen eine COOH-terminal verkürzte Variante (dom15kurz) hergestellt wurde, die auch die Auflösung von Mehrdeutigkeiten bei NOE-Kreuzresonanzen erlaubte. Aus den homonuklearen und 15N-editierten NMR-Spektren wurden 887 (dom15kurz) bzw. 908 (dom15) experimentelle Randbedingungen gewonnen, die die Berechnung einer jeweils hochaufgelösten Struktur mit einem RMSD-Wert von 0,5 Å für die schweren Atome des Proteinrückgrats bzw. von 1,0 Å für alle schweren Atome ermöglichten. Beide Varianten zeigen ein typisches Kazal-Strukturmotiv bestehend aus einem dreisträngigen beta- Faltblatt, einer zentralen alpha-Helix und einer exponierten kanonischen Bindungsschleife. Die gegenüber klassischen Kazalvertretern zusätzlichen Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen sind teilweise an der Ausbildung einer weiteren aminoterminalen kurzen Helix und einem hairpin-ähnlichen Motiv beteiligt und so angeordnet, dass der klassische Kazal-Faltungstyp nicht gestört wird. Sowohl die kurze als auch die lange Domäne 15-Variante zeigt eine starke und nicht-temporäre kompetitive Inhibierung von Trypsin und Plasmin bei Werten für die Inhibitionskonstanten im einstelligen nM-Bereich, jedoch keine inhibitorische Wirkung gegenüber Tryptase. Aufgrund des identischen Verhaltens dieser beiden Domäne 15-Varianten gegenüber verschiedenen getesteten Proteinasen ist anzunehmen, dass der COOH-Terminus keinen Einfluss auf die inhibitorische Wirkung der LEKTI-Domäne 15 hat. Außerdem wurde in Anlehnung an LDTI eine Variante der Domäne 15 mit nur einer Aminosäure zwischen den ersten beiden Cysteinen (dom15ldti) hergestellt. Nach oxidativer Rückfaltung zeigte dom15ldti ebenfalls eine starke inhibitorische Wirkung gegenüber Trypsin und Plasmin, wie sie auch für dom15 und dom15kurz beobachtet wurde. Dies deutet auf eine starre Bindungsschleife und ein hoch stabilisiertes Proteingerüst hin. Daher wurde ein Strukturmodell für dom15ldti auf Basis der experimentell bestimmten Struktur von dom15kurz erstellt. Reoxidiertes dom15ldti zeigte eine Inhibierung von Chymotrypsin, Elastase und Subtilisin, während dies weder für dom15 noch für dom15kurz beobachtet wurde. Dies lässt darauf schließen, dass der Bereich zwischen den ersten beiden Cysteinen einen Einfluss darauf hat, welche Proteinase inhibiert wird. Aus Überlagerungen der Strukturen von dom15kurz und der Modellstruktur von dom15ldti mit verschiedenen Proteinase-Inhibitor-Komplexstrukturen kann eine sterische Hinderung als mögliche Ursache für das unterschiedliche inhibitorische Verhalten gegenüber verschiedenen Proteinasen abgeleitet werden. Diese Erkenntnis stellt eine mögliche Grundlage für gezielte Veränderungen einer inhibitorischen Selektivität dar. Außerdem erleichtert die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur der LEKTI-Domäne 15 die Suche nach der immer noch unbekannten Zielproteinase.

Strukturbestimmung von Birkenpollenallergenen und birkenpollenassoziierten Nahrungsmittelallergenen mit NMR-Spektroskopie (2003)

Philipp Neudecker

Das 17,4kDa schwere Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 ist bei mehr als 90% der Birkenpollenallergiker für die Bindung der IgE-Antikörper verantwortlich, und IgE-Kreuzreaktionen mit verwandten Proteinen wie Pru av 1 (früher Pru a 1) aus Kirschen, Gly m 4 (ursprünglich SAM22) aus Sojabohnen und Api g 1 aus Sellerie verursachen bei bis zu 70% dieser Patienten allergische Reaktionen auf Nüsse, Obst oder Gemüse. Die molekulare Grundlage für die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Pru av 1 stellt die fast vollständige Identität ihrer Tertiärstrukturen dar. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten NMR-spektroskopischen Untersuchungen erbrachten den experimentellen Nachweis, dass der ungewöhnlich große hydrophobe Hohlraum im Innern von Pru av 1 mit Steroiden wechselwirkt. Modellierungen zeigten, dass der Hohlraum groß genug für zwei Steroidmoleküle ist, und erlaubten die Vorhersage der Komplexstruktur. Die Konformation des Proteinrückgrats von Pru av 1 wt ist in der hochaufgelösten dreidimensionalen Struktur der weniger IgE-reaktiven Mutante Pru av 1 E45W in Lösung konserviert, was zeigt, dass die Seitenkette von Glu45 an einem kreuzreaktiven IgE-Epitop beteiligt ist. Dementsprechend wurde die IgE-Bindung an Api g 1.0101 durch die Mutation K44E erhöht. Der fast vollständige Verlust der IgE-Bindung an Pru av 1 S112P ist die Folge einer Zerstörung der Tertiärstruktur. Weder die Mutation S112A noch die Deletion der COOH-terminalen Reste 155-159 beeinflusste die IgE-Bindung an Pru av 1. Die P-Schleife um Glu45 erklärt somit teilweise das klinisch beobachtete IgE-Kreuzreaktionsmuster und ortsgerichtete Mutagenese von Glu45 stellt einen Ansatz zur Entwicklung hypoallergener Varianten für die spezifische Immuntherapie dar. Als Ausgangspunkt zur Schließung der strukturellen Lücke zwischen der konstitutiv exprimierten Bet v 1-Familie von Allergenen und der verwandten stressinduzierten PR-10-Familie von mit Krankheitsbefall zusammenhängenden Proteinen wurde der Großteil der 1H-, 13C- und 15N-Resonanzen des stressinduzierten PR-10-Proteins Gly m 4 zugeordnet und eine Reihe von NOESY-Spektren aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen, skalaren und dipolaren Kopplungskonstanten bestätigen ein auf der Grundlage von Pru av 1 und Bet v 1 erstelltes Homologiemodell, so dass die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Gly m 4 ebenfalls auf einer praktisch identischen Tertiärstruktur beruht. Zwischen 5% und 20% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 9,4kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 4, ein Ca2+-bindendes Polcalcin. Wegen der hohen IgE-Kreuzreaktivität der Polcalcine sind viele Patienten auf Pollen verschiedenster Pflanzen polysensibilisiert. Die mit mehrdimensionaler heteronuklearer NMR-Spektroskopie bestimmte hochaufgelöste dreidimensionale Struktur von holo Bet v 4 zeigt ein kanonisches EF-Hand-Paar in der offenen Konformation. Die hochkonservierte polcalcinspezifische amphipatische COOH-terminale a-Helix deckt lediglich einen Teil der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche von holo Bet v 4 ab. Anders als das Polcalcin Phl p 7 aus dem Wiesenlischgras, für das vor kurzem eine durch Domain Swapping entstandene dimere Struktur nachgewiesen wurde, zeigen die hydrodynamischen Parameter aus NMR-Relaxation, NMR-Translationsdiffusion und analytischer Ultrazentrifugation, dass sowohl apo als auch holo Bet v 4 vorwiegend monomer sind. Die geringere Dispersion der chemischen Verschiebungen und der etwas größere hydrodynamische Radius von apo Bet v 4 weisen auf eine reversible Änderung der Struktur bei Ca2+-Bindung hin, was die geringere IgE-Bindungsfähigkeit von apo Bet v 4 erklärt. Trotz ihrer unterschiedlichen Oligomerisierungszustände sind die Tertiärstrukturen von holo Bet v 4 und holo Phl p 7 bemerkenswert ähnlich, was eine zwanglose Erklärung für die IgE-Kreuzreaktivität liefert. Zusammen mit der engen strukturellen Homologie zu Calmodulin und der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche weist diese Änderung der Struktur eher auf eine regulatorische denn eine Ca2+-Speicherfunktion für Bet v 4 hin. Etwa 12% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 34,2kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 6 (früher Bet v 5), das hochgradig IgE-kreuzreaktiv mit Pyr c 5 aus Birnen ist. Die Tertiärstruktur dieser Phenylcoumarin-Benzylether-Reduktasen ist noch unbekannt. Die homonuklearen NMR-Spektren von Pyr c 5 zeigen eine ausgezeichnete Dispersion der chemischen Verschiebungen, was auf eine gemischte a/b-Sekundärstruktur hindeutet. Der Ausschluss vernachlässigbarer Terme durch Einführung eines geeigneten Grenzwerts sparte einen erheblichen Teil der durch die Verwendung des gaußförmigen Datenbank-Potentials verursachten Zunahme des Rechenzeitbedarfs der Strukturberechnung dieser Allergene ein, ohne die Qualität der resultierenden Strukturen zu beeinträchtigen. Außerdem wurden mehrere Inkonsistenzen in der Standardparametrisierung der kovalenten Geometrie des Kraftfelds beseitigt.

Strukturbestimmung des humanen Guanylin-Prohormons zur Analyse der Rolle einer Hormon-Prosequenz und Design eines löslichen Fragments der extrazellulären Domäne der Guanylatzyklase-C (2003)

Thomas Lauber

Die Peptidhormone Guanylin und Uroguanylin sind als spezifische Liganden der intestinalen membrangebundenen Guanylatzyklase-C (GC-C) entscheidend an der Regulation des Flüssigkeits- und Elektrolythaushalts im Darm beteiligt. Obwohl die Rolle dieses Guanylin/GC-C Systems bei der durch die hitzestabilen bakteriellen Enterotoxine vermittelten Diarrhöe schon lange bekannt ist, kennt man bis heute keine strukturellen Details der Vorläuferproteine der GC-C-Liganden, der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne der GC-C (GC-CECD) und der Liganden/Rezeptor-Wechselwirkung. Um zum Verständnis der biochemischen Eigenschaften des Guanylin-Prohormons beizutragen sowie den Einfluß der Prosequenz auf die Ausbildung der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Disulfidbrücken zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Struktur von humanem Proguanylin bestimmt. Weiterhin wurde als Grundlage für weiterführende NMR-spektroskopische Untersuchungen der Guanylin/GC-C-Wechselwirkung ein geeignetes Fragment der GC-CECD konstruiert. Um die Strukturbestimmung von Proguanylin zu ermöglichen, wurde zunächst ein effizientes Expressions- und Reinigungsprotokoll entwickelt, das es erlaubte, Proguanylin mit der nativen Disulfidverbrückung und natürlichen biologischen Aktivität in löslicher Form zu gewinnen. Durch den Vergleich mit dem natürlichen, aus menschlichem Hämofiltrat isolierten Prohormon wurden für beide Proteine übereinstimmende biophysikalische Eigenschaften und dreidimensionale Strukturen nachgewiesen. Des Weiteren wurde mittels analytischer Sedimentationsexperimente für beide Proteine eindeutig ein monomerer Assoziationsgrad in Lösung auch bei millimolaren Konzentrationen nachgewiesen und dadurch ein früher postulierter dimerer Zustand widerlegt. Die anschließende Berechnung der dreidimensionalen Struktur von Proguanylin erfolgte durch die Verwendung von 700 aus den NMR Spektren des homogen 15N und 13C/15N markierten rekombinanten sowie des natürlichen Proteins abgeleiteten experimentellen Randbedingungen. Die Struktur von Proguanylin in Lösung stellt einen neuen Proteinfaltungstyp dar und weist drei zu einem Bündel zusammengelagerte alpha-Helices, ein kurzes, dreisträngiges, antiparalleles beta-Faltblatt sowie einen 23 Aminosäuren umfassenden unstrukturierten Bereich auf. Da das Faltblatt durch zwei N-terminale und einen C-terminalen Strang gebildet wird, kommt es zu einer unmittelbaren Nachbarschaft der Termini. Dabei wird die Hormonregion (Reste 80-94) von Proguanylin unter anderem durch die Wechselwirkungen mit dem N-terminalen Faltblattstrang in einer Guanylin A-Isomer ähnlichen Topologie stabilisiert. Diese Kontakte bewirken außerdem eine teilweise Abschirmung der ansonsten im freien Hormon zugänglichen Oberfläche und können daher die äußerst geringe Affinität bezüglich der GC-C und die damit verbundene vernachlässigbare Aktivität von Proguanylin erklären. Eine beobachtete Wechselwirkung zwischen der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Seitenkette von Tyr88 mit Arg72 leistet einen zusätzlichen Beitrag zur Inaktivierung der Hormonregion. Die Wechselwirkungen zwischen den terminalen Bereichen in der Proguanylin-Struktur scheinen außerdem für die Ausbildung der nativen Disulfidverbrückung essentiell zu sein. Eine Bestätigung dieser Annahmen wurde aus der Analyse von Proguanylin-Mutanten erhalten, die eine strukturstabilisierende Funktion der Disulfidbrücke C48-C61 nahelegt und für einen direkten Einfluß der Prosequenz auf die Struktur der Hormonregion spricht. Basierend auf einer weiteren Mutante konnte außerdem für das homologe Uroguanylin-Prohormon ein Strukturmodell erstellt werden. Für die GC-CECD wurde ein Strukturmodell erstellt, mit dessen Hilfe die Ligandenbindungsregion auf die direkte Umgebung eines exponierten und zugänglichen Faltblattstrangs kartiert werden konnte. Daher wurde für die Wechselwirkung zwischen Guanylin und der GC-CECD ein zu den intramolekularen Kontakten zwischen Guanylin und der Prosequenz ähnliches Interaktionsmotiv postuliert. Aufgrund der Größe und des Oligomerzustandes ist die GC-CECD nicht für NMR-spektroskopische Untersuchungen zur detaillierten Charakterisierung der Wechselwirkung dieses Rezeptors mit seinen Liganden geeignet. Daher wurde ein kleineres, lösliches, strukturiertes und zur Ligandenbindung fähiges Rezeptorfragment benötigt, das in Form der als miniGC-C bezeichneten membrannahen Subdomäne der GC-CECD konstruiert wurde. Dieses Fragment erfüllt die gewünschten Anforderungen und ist zur hoch affinen Bindung des Liganden STp-(5-17) in der Lage. Zur Untersuchung des zugehörigen Komplexes stellt das entwickelte Expressions- und Reinigungssystem zur Gewinnung von rekombinantem Proguanylin gleichzeitig die Grundlage für die Herstellung von homogen 15N und 13C/15N markiertem Guanylin dar, welches für zukünftige NMR-spektroskopische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Guanylin und der GC-C benötigt wird.

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