218 search hits
-
Polyelectrolyte Coatings with Internal Hierarchy
(2013)
-
Julia Gensel
- The results presented in this thesis are focused on the surface modification by polyelectrolytes and polyelectrolyte copolymers. The internal structural hierarchy originate thereby from the self-assembly processes at different length scales. To generate different levels of hierarchy, the coatings were constructed by using either the layer-by-layer (LbL) deposition method (lateral chemical structure), the adsorption of supramolecular aggregates (lateral topographycal structure), or the combination of both. Using these techniques, one can control the properties of the coatings by varying the chemical structure of the polyelectrolytes, for instance, their charge density, thus providing a convenient way for their functionalization and the ability to tune properties of the surface. Therefore, we were working with systems which have variable charge densities. With this approach, we were able to produce thin and ultrathin nanostructured films with tunable properties and functionality.
-
Structural analysis of nanoparticles by small angles X-ray scattering
(2013)
-
Christophe N. Rochette
- The objective of this work was to analyze nano-scaled particles by the combination of small angle x-ray scattering (SAXS), electron microscopy (TEM and cryo-TEM) and dynamic light scattering (DLS). Two systems with totally di_erent morphologies and compositions have been investigated: spherical particles of calcium-phosphate-protein complexes and hamburgers of semi-crystalline polybutadiene/polyethylene nanoparticles.
The study of the calcium-phosphate-protein complexes consisted in looking for the influence of a protein, Fetuin-A, also called ahsg, onto the calci_cation at early stage. For the purpose, calcium and phosphate ions were mixed with or without the presence of Fetuin-A in a buffr solution of pH=7.4. In a first step, DLS measurements were realized to better appreciate the effect of the total weight percentage of Ca2+ and PO43- ions. These experiments, withtout addition of ahsg, demonstrated that for a lower weight fraction, the particles formed are smaller. Studies with addition of Fetuin-A affected the calcification during the first minute of this process. The early formation of calcium phosphate complexes has been successfully followed by TR-SAXS. A very fast nucleation of nanoparticles within 1 second has been detected. For the first time, the role of the glycoprotein Fetuin-A at the very early stage of calcification has been qualitatively highlighted: ahsg inhibits the aggregation of calcium phosphate particles. Thus, Fetuin-A plays an important role in the fetal serum in the pre-formation of the skeleton of Vertebrates. This study demonstrated that a physiological concentration of this glycoprotein (15 µM) is suffcient to completely inhibit the aggregation of calcium phosphate particles.
Freely suspended nanoparticles of syndiotactic polybutadiene have been studied. By using the combination of cryo-TEM and SAXS, it has been shown that they consist of remarkably thin polymer crystalline lamella. Different models have been compared in order to theoretically fit the experimental SAXS data: homogeneous and heterogeneous (two and three different electron densities within one particle) nanoparticles. The presence of amorphous and crystalline polybutadiene has been demonstrated by the X-ray diffraction. The necessity of using an additional layer of SDS for the modeling is explained by the abundancy of SDS added after the synthesis of the polybutadiene particles (weight ratio ca. 1:1) and by the modeling of the SAXS theoretical intensities which were not sufficient without taking into account the presence of SDS. After the formation of semi-crystalline nanoparticles of PE, these new nanoparticles open a new route to the synthesis of nanopolymers of interesting physico-chemical properties such as semi-conductors or photovoltaic compounds.
Finally, in contrast to recent literature on bulk polyethylene (PE), this thesis investigated freely suspended nanoparticles of PE. As suggested by Weber and coworkers, the combination of SAXS and cryo-TEM has been used for this study. The structure of individual PE nanocrystals has been determined in detail and an improved model of the form factor (SAXS) has been developped in close collaboration with Priv.-Doz. Dr. Ludger Harnau. The second part of this thesis mainly deals with the annealing of these PE particles. For the first time, it is shown that the effect of the annealing process results in a doubling of the crystalline layer of the PE nanoparticles. This behaviour could be traced back to the unlooping of the PE chains. In addition, a linear relationship between the reciprocal of the crystalline layer and the annealing temperature has been experimentally drawn. This line was predicted by the Gibbs-Thomson equation according to the literature. This result is important because it allows controlling the crystalline thickness and physical properties of the system, by the temperature.
-
Effects of copper on calcium metabolism and detoxification mechanisms in freshwater bivalve species of Anodonta
(2013)
-
Olivier Santini
- Copper (Cu) is one of the metals contaminating European fresh water ecosystems. Filter feeding bivalves have high bioaccumulation potential for transition metals as Cu. While copper is an essential micronutrient for living organisms, it causes serious metabolic and physiological impairments when in excess.
The objectives of this thesis are to get knowledge on toxic effects and detoxification mechanisms of copper in Anodonta cygnea and Anodonta anatina, two mussel species widely distributed in continental waters. Because Ca plays a fundamental role in shell formation and in numerous biological processes, Cu2+ effects on cellular plasma membrane calcium transport were studied first. In the second step, the investigations focused on Cu2+ detoxification mechanism involving cysteine (Cys) rich compounds known to play a major role in homeostasis of essential trace metals and in cellular metal detoxification.
Under our experimental conditions, copper inhibition of Ca2+-ATPase activity was observed in the gills and the kidneys, and inhibition of Na+/K+-ATPase in the gills and the digestive gland (DG) upon 4 d of exposure to 0.35 micro mol/L Cu2+. At day 7 of exposure to environmental Cu2+ concentrations total recoveries was observed in the kidneys and the gills for Ca2+-ATPase activity, and in the DG for Na+/K+-ATPase, but not at high doses. Ca and Na transport inhibition may entail disturbance of osmo-regulation and lead to continuous under-supply of Ca. Recoveries of Na+/K+-ATPase and Ca2+-ATPase enzymes function suggest that metal-detoxification is induced.
Phytochelatins (PC) are Cys-rich oligopeptides synthesised by phytochelatin synthase from glutathione in plants and fungi. Phytochelatin synthase genes have recently been identified in invertebrates; this allows us to hypothesize a role of PC in metal detoxification in animals.
In the second part of this work, PC and their precursors as well as metallothionein were analyzed in the gills and in the DG of Anodonta cygnea exposed to Cu2+. Our results showed for the first time the presence of PC2-4 in invertebrates. PC were detected in control mussels not exposed to metal, suggesting a role in essential metal homeostasis. Compared to control, PC2 induction was observed during the first 12 h of Cu2+ exposure. Those results confirm the role of PC as a first line detoxification mechanism in A. cygnea.
-
Organic Electronics by Self-Assembly
(2013)
-
Andreas Ringk
- This thesis deals with the synthesis of new materials and their applications in n type field-effect transistors in order to improve device performance by using simple fabrication procedures at low temperatures.
The first approach deals with field effect transistors based on zinc oxide nanoparticles. Stable dispersions of zinc oxide nanoparticles allow the fabrication of zinc oxide transistors by solution processes. Despite the high intrinsic electron mobilities of zinc oxide, a large surface to volume ratio of nanoparticles often prevents their use as active material in field-effect transistors. Dangling zinc bonds are present at the surface, which act as electron donor, leading to increased conductivity. Switching the transistor off becomes challenging. The use of a tailored perylene bisimide, chemically linked to pyrrolidone groups, allowed the passivation of the dangling zinc bonds at the particle surface. Mixing of this perylene bisimide into nanoparticulate zinc oxide dispersions allowed transistor fabrication by spin-coating at low temperatures. On/off-ratios of the resulting transistors could be enhanced by 3 orders of magnitude to 10^3, so that zinc oxide nanoparticles turn into a semiconductor.
The second approach represents the main part of this thesis focusing on n type self assembled monolayer field-effect transistors (SAMFETs). It is known that approximately 90% of charge transport in field-effect transistors is managed just by an ultra-thin layer close to the dielectric. Due to the absence of bulk current, on/off ratios in SAMFETs are enhanced without disadvantages to charge mobility or threshold voltage. The molecules for SAMFET applications typically consist of a semiconducting core, an endcapper on one side, and a reactive group on the other side, which is fixed to the core via a spacer. In this thesis, the well known perylene bisimides were chosen as semiconducting core. A branched alkyl tail acted as endcapper, whereas a linear C11 alkyl tail takes over the spacer part. As reactive group a phosphonic acid was chosen, which enables covalent fixation to aluminium oxide, a common dielectric for transistor applications. SAMFETs were fabricated by submerging transistor substrates into a dilute solution of the active molecule. During the immersion, the perylene bisimides reacts spontaneously to the aluminium oxide dielectric, forming a monomolecular layer. X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) revealed a dense, homogeneous, and smooth monolayer on top of aluminium oxide. X-ray reflectivity (XRR) measurements confirmed the expected three regions, endcapper, semiconducting core, and spacer, perpendicularly ordered to the surface. In plane order was investigated by grazing incidence measurements (GIXD), which resulted in a nano-crystalline layer. SAMFETs showed bulk like electron mobilities of 10^-3 cm2/Vs. High on/off-ratios up to 10^5 and low threshold voltages were achieved. SAMFETs with channel length up to 100 micrometer were measured for the first time. The fact that all measured transistors, short channel as well as long channel, were working, indicated a high degree of reproducibility. Furthermore, by combining n-type and p type SAMFETs, the first CMOS bias inverter, solely based on SAMFETs, with large gain values up to 15, was realized.
To further improve SAMFET performance, the branched alkyl tail was replaced by a short linear fluorinated alkyl tail, with the intention to increase the surface coverage of the chromophores by a more slender design of the molecule. SAMFETs were fabricated with the same simple method as described above. XPS measurements showed a complete coverage of an organic layer with a thickness matching perfectly the simulated length of the molecule. In contrast to the previous SAMFETs, the phosphorous was located mainly at the aluminium oxide surface and not, as before, throughout the organic layer. The fluorine atoms were detected at the top of the layer. Both observations are indicative for higher order of the monolayer. XRR measurements gave a consistent structure of the layer. A tree layer structure was found in which the electron density of the outer layer was enhanced, due to the presence of electron rich fluorine atoms. The thicknesses of all three layers were in good agreement to the calculated distances. Furthermore, GIXD studies revealed an amorphous SAM on top of aluminium oxide, optimal for charge transport without disturbing grain boundaries.
The new SAMFETs were also highly reproducible and showed electron mobilities on the order of 10^-3 cm2/Vs, low onset voltages, and high on/off-ratios in the order of 10^6. Besides SAMFETs on common non-flexible silicon substrates, comparable n-type SAMFETs were also fabricated on polymer based substrates for the first time. Furthermore, a unipolar bias inverter was built, paving the way towards flexible organic electronics by self-assembly.
In summary, all three publications of this thesis deal with the synthesis of semiconducting perylene bisimides and their implementation in n-type field-effect transistors. Reliable transistors and the first integrated CMOS-like circuits based solely on SAMFETs with high performances were achieved, made by simplest solution processes at low temperatures.
-
Biochemical and structural characterization of Sirtuins from mammals and Thermotoga maritima
(2012)
-
Mahadevan Lakshminarasimhan
- Sirtuins are NAD+ dependent protein deacetylases involved in regulation of metabolism, age related diseases and are suggested to mediate lifespan extending effects of calorie restriction. Mammals contain seven Sirtuin soforms with various cellular localizations and substrate preferences. This work focuses on the structural and biochemical characterization of several mammalian Sirtuin isoforms, with main emphasis on the largest member of the family, Sirt1.Analysis of various Sirt1 constructs using analytical ultracentrifugation and electron microscopy techniques identified it to be a monomer, similar to other mammalian isoforms. Comparison of activity between different Sirt1 constructs indicates that the termini might be involved in regulating the protein’s activity. It could be shown that the catalytic domain of Sirt1 is sufficient for its activation by the lifespan extending polyphenol resveratrol and that resveratrol can directly bind to Sirt1. Using a peptide array harboring all known mammalian acetylation sites several novel substrates for Sirt1 were identified and shown that resveratrol and other small molecules can modulate Sirt1 dependent deacetylation of substrate peptides and that the effect is specific for the sequence of the substrate site. This finding reveals exciting possibilities for the development of new modulators targeting only specific substrates of Sirt1. These compounds can further be used in analyzing the functions of Sirtuins in vivo and can also serve as attractive leads for developing Sirt1 specific drugs. Studies on the mitochondrial isoform Sirt3 revealed that Zinc is essential for the structural integrity of Sirtuins. Investigations on Sirt5, also a mitochondrial Sirtuin appears to indicate that it is insensitive to nicotinamide (a physiological inhibitor of Sirtuins). Studies on the nucleolar isoform Sirt7 identified Thr224 to be phosphorylated, and play a role in the enzyme’s activity. The thermotoga maritima Sirtuin Sir2Tm was used as a model system for structural characterization of Sirt1. The crystal structure of Sir2Tm in complex with Ex-527, a potent Sirt1 inhibitor was solved, which combined with biophysical studies offers information about Ex-527 binding and inhibition. Close contacts between Ex-527 and some form of ADP-ribose, possibly the product O-acetyl-ADP-ribose (which is not yet fully verified) in the closed enzyme conformation prevent the release of products, thereby stalling the enzymatic reaction. These results offer insights into the isoform specific inhibition of Sirtuins by Ex-527 and provide information for further improvement of Sirt1 specific inhibitors.
-
Novel microemulsions with an anionic/non-ionic surfactant mixture
(2012)
-
Lukas Wolf
- Mikroemulsionen bestehen im einfachsten Fall aus Wasser, Öl und Tensid(en). Es handelt sich dabei im Gegensatz zu normalen Emulsionen um transparente, thermodynamisch stabile Phasen. Diesen makroskopisch einphasig erscheinenden Systemen liegen jedoch hoch komplexe Nanostrukturen zu Grunde. Die in wissenschaftlicher Hinsicht bislang am besten untersuchten und verstandenen Mikroemulsionssysteme bestehen entweder aus Wasser, Öl und einem einzigen elektrisch ungeladenen nicht-ionischen Tensid oder einem elektrisch geladenen ionischen Tensid. Beide Systeme unterscheiden sich grundlegend, unter anderem in ihrem Phasenverhalten, ihrer Temperaturstabilität oder ihren Nanostrukturen. Systeme mit Mischungen aus ionischen und nichtionischen Tensiden dagegen wurden bisher kaum untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Phasenverhalten einer anionischen/nichtionischen Tensidmischung mit verschiedenen Ölen bei konstanter Temperatur und konstantem Tensidgehalt untersucht. Die Phasendiagramme weisen jeweils zwei optisch isotrope Phasengebiete, so genannte Einphasenkanäle, mit steigendem Öl-Gehalt auf. Die beiden Mikroemulsions-Einphasenkanäle sind voneinander durch ein optisch anisotropes Phasengebiet getrennt. Der Mikroemulsionskanal unterhalb des anisotropen Bereichs erstreckt sich von der wässrigen Phase ausgehend mit wachsendem Öl- und nichtionischen Co-Tensid-Anteil bis in die Mitte des Phasendiagramms und endet dort. Der obere Einphasenkanal verläuft durch ein steiles Minimum, in Bezug auf das Tensid/Co-Tensidverhältnis, durchgehend von der wässrigen zur ölreichen Seite des Phasendiagramms. Im Gegensatz zu Mikroemulsionen mit nichtionischen Tensiden handelt es sich um isotherme Einphasenkanäle. Die einphasigen Gebiete wurden mit diversen physikalisch-chemischen Methoden untersucht. Mittels Leitfähigkeits-, SANS-, PFG-NMR-Messungen und elektronenmikroskopischen cryo-TEM Aufnahmen konnten die Nanostrukturen identifiziert werden. Während im unteren Einphasenkanal die Strukturen aus kleinen Öl-Tröpfchen in einer kontinuierlichen Wasserphase bestehen, welche mit zunehmendem Öl-Gehalt anschwellen, kommt es im oberen Einphasenkanal zu einer komplexen Strukturänderung. Während der ölfreien Probe eine bikontinuierliche Schwammstruktur zu Grunde liegt, wandelt sich diese mit bereits wenigen Prozent an Öl zu einer polyedrischen Wasser-in-Öl Schaumstruktur. Für diese, in Mikroemulsionen bislang unbekannten, Struktur wurde der Begriff High Internal Phase Microemulsion (HIPME) eingeführt, aufgrund ihrer strukturellen Parallelen zu bereits bekannten High Internal Phase Emulsionen (HIPE). Mittels transienter Elektrodoppelbrechung konnte dieser komplexe strukturelle Übergang nachvollzogen werden. Die ermittelten strukturellen Relaxationszeiten, welche zudem die Viskosität der Mikroemulsionen bestimmen, weisen ein deutliches Maximum am Übergangspunkt von der bikontinuierlichen zur HIPME-Struktur auf. Grund für die beobachtete HIPME-Struktur ist vermutlich der Anteil der elektrischen Ladung des anionischen Tensids. Diese sorgt für eine vergleichbar hohe Grenzflächenspannung zwischen der wässrigen verdünnten Tensid-Phase und des Öls. Konsequenz dieser hohen Grenzflächenspannung sind ölkontinuierliche Schaumstrukturen anstatt bikontinuierlicher Strukturen, welche man in vergleichbaren Mikroemulsionen mit rein nichtionischen Tensiden erhält. Durch Abschirmen der elektrischen Ladungen mit Salz werden die HIPME-Strukturen gestört, was sich in einem Ansteigen der Leitfähigkeit und einer erhöhten Mobilität der Wasserphase äußert, welche mit NMR beobachtet wurde.
-
Unique Emulsions based on recombinant Hydrophobins
(2012)
-
Martin Reger
- Hydrophobins are very interesting proteins of fungal origin. Beside their relatively small size of around 100 amino acids, they are well known to be the most surface active, natural proteins that have a strong tendency for self-assembly. Due to their versatile properties hydrophobins are present in different fungal structures, like as coaters of hyphae. These diversified properties of hydrophobins raised great interest among scientists. Possible applications in surface modification or emulsion industry were always restricted by the cost and effort of natural hydrophobin purification. This changed dramatically by the use of white biotechnology resulting in the availability of high amounts of recombinant hydrophobins nowadays. This study started with the physicochemical characterization of two recombinant hydrophobins, called H Star Proteins ® A and B. Both show a remarkable, time-dependent surface activity as well as a distinct aggregation behaviour indicating them to have the typical properties of natural hydrophobins. The use of the recombinant hydrophobins as emulsifier resulted in the formation of gel-like oil in water emulsions. Interestingly, without the occurrence of typical emulsion instability processes like creaming or coalescence, these emulsions showed significant aging effects. We conclude them to be the consequence of the time-dependent formation and progression of a self-supporting, three-dimensional protein network that evolves in the emulsion. The self-assemble tendency of recombinant hydrophobins is clearly not limited by adsorption to the oil-water interface. Obviously the long term stability of the emulsion is determined by the sticky character of the hydrophobin coated oil droplets that attract each other in the short range distance. This type of emulsion stabilization mechanism is absolutely novel in the field of emulsion technology. Moreover we used the hydrophobins’ ability of surface modification in order to coat disk-like clay particles. These clay-hydrophobin sandwiches were used for the formation of Pickering Emulsions. It turned out that the synergistic use of clay and hydrophobin resulted in homogenous, long-term stable and tooth-paste like emulsions. The clay particles improved strikingly the rigidity and elasticity of the self-supporting hydrophobin network. Substitution of the clay particles by boehmite needles resulted in similar Pickering emulsions. Finally, we report that it is possible to replace hydrophobin in combination with clay by other proteins, amphiphiles or surfactants. By adjusting the preparation conditions, the emulsifier concentration or the oil mass fraction one has a versatile tool to obtain Pickering emulsions with the desired properties. A new stabilization mechanism in emulsion science is introduced, supported and confirmed by our results.
-
Template-Directed Synthesis of One-Dimensional Hybrid Nanostructures from Cylindrical Polymer Brushes
(2012)
-
Markus Müllner
- The thesis deals with the study of cylindrical polymer brushes (CPBs) and their use in template chemistry. Herein, we developed template-directed syntheses of one-dimensional (1D) hybrid nanostructures in which CPBs served as 1D soft templates. So called ‘molecular’ core-shell or core-shell-corona CPBs, as well as CPBs obtained through microphase separation of diblock copolymers, were applied as templates for the preparation of various types of 1D organic-inorganic hybrid nanomaterials. Well-defined molecular core-shell and core-shell-corona CPBs with a narrow molecular weight distribution in both the backbone and the side chains have been synthesized via the combination of several polymerization techniques. Anionic polymerization has enabled the precise synthesis of polymer backbones, whereas atom transfer radical polymerization and ring-opening polymerization have allowed the sequential growth of side chains via the ‘grafting-from’ approach. Depending upon the desired functional 1D hybrid nanostructures, different combinations of core, shell and corona have been chosen. Core-shell-corona CPBs with a poly(tert-butyl acrylate) (PtBA) core, a poly(3-acryloylpropyl trimethoxysilane) (PAPTS) shell and a poly[oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate] (POEGMA) corona were hydrolyzed by aqueous ammonia to produce water-soluble organo-silica hybrid nanotubes. As the trimethoxysilyl group was directly incorporated into the structure of the CPBs, we avoided the addition of an external inorganic precursor. Amphiphilic core-shell-corona CPBs with a hydrophobic poly(ε-caprolactone) (PCL) core, a hydrophilic poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) (PDMAEMA) shell and a hydrophilic POEGMA corona were used as 1D templates and nanoreactors for the fabrication of titania dioxide (TiO2) semiconductor nanotubes. The cationic PDMAEMA shell was loaded with a negatively charged titania precursor, namely titanium(IV) bis(ammonium lactate) dihydroxide (TALH). TALH underwent hydrolysis within the CPB shell upon heating above 70 °C. Accordingly, crystalline (that is, anatase) TiO2 hybrid nanotubes with a very well defined thickness were obtained. Subsequently, the diameter of the hybrid nanotubes was adjusted by modifying the side chain length of the PDMAEMA shell. Amphiphilic core-shell CPBs with a hydrophobic PCL core and a hydrophilic PDMAEMA shell were employed for the fabrication of silica nanotubes with different aspect ratios. Tetramethyl orthosilicate (TMOS) was used for the deposition of silica into the PDMAEMA shell. Several polymers with different dimensions, with respect to length as well as core and shell diameter, were synthesized and used as templates for the fabrication 1D silica nanostructures. Furthermore, silica nanotubes were obtained after acid treatment or calcination, and catalytically active porous nanomaterials were produced via the embedment of metal nanoparticles within the silica shell. All the hybrid nanotubes templated by molecular core-shell and core-shell-corona CPBs were uniform in length as well as diameter, due to the narrow molecular weight distribution of the CPB backbone and side chains. Moreover, the POEGMA corona in the core-shell-corona CPBs served as a shielding layer and protected the nanotubes from agglomeration and intermolecular crosslinking during the hybrid formation. Additionally, POEGMA rendered the hybrid nanomaterials soluble in various solvents, including water. Water-soluble core-shell CPBs were obtained from microphase separated cast films of polystyrene-b-poly(allyl methacrylate) (PS-PAMA) diblock copolymers. After UV-crosslinking of the cylindrical PAMA domains, CPBs with a PS shell and a crosslinked PAMA core were obtained. Subsequent sulfonation rendered the PS shell into poly(styrenesulfonic acid) and thereby made it water-soluble. The negatively charged brush templates were infiltrated with oppositely charged TiO2 nanocrystals to produce crystalline TiO2 hybrid nanowires. Further, it was possible to adjust the crystal structure of the nanostructures to either a rutile or anatase structure. The presented novel 1D hybrid nanomaterials based on CPBs have many potential applications due to their electronic, catalytic and semiconducting properties.
-
Charakterisierung und Funktionalisierung von Filmen aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen
(2012)
-
Kristina Spieß
- Spinnenseide stellt aufgrund ihrer mechanischen und chemischen Eigenschaften ein faszinierendes Protein-basiertes Material mit Potential für vielfältige Anwendung in technischen und biomedizinischen Bereichen dar. Rekombinant hergestellte Spinnenseidenproteine können neben der natürlichen Assemblierungsform des Fadens zu diversen Morphologien, wie Vliesen, Mikropartikeln, Kapseln oder Filmen verarbeitet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Filme aus dem rekombinant produzierten Protein eADF4(C16) umfassend charakterisiert. eADF4(C16)leitet sich von der repetitiven Kerndomäne des Proteins ADF4 ab, welches ein Hauptbestandteil der sog. dragline Seide der Europäischen Gartenkreuzspinne Araneus diadematus ist. Der Einfluss verschiedener Prozessparameter auf bestimmte Eigenschaften des resultierenden Films wurde systematisch untersucht. Die Variablen umfassten dabei die Wahl des Lösungsmittels zum Gießen des Films (Hexafluoroisopropanol, Ameinsensäure sowie ein wässriger Puffer), die Art der Nachbehandlung (Methanol bzw. Ethanol sowie Kaliumphosphatlösung), sowie die relative Luftfeuchtigkeit. Alle Parameter zeigten dabei einen Einfluss auf die Sekundärstruktur der Proteine im Film. Zusätzlich wurden die thermische, chemische und mechanische Stabilität der Filme sowie ihre Oberflächeneigenschaften analysiert. Während sich alle untersuchten Filme kaum in ihrer thermischen Stabilität unterschieden, zeigte sich ein deutlicher Einfluss des verwendeten Lösungsmittels und der Nachbehandlung auf das mechanische Verhalten der Filme unter linearer Zugbelastung. Chemische und mechanische Eigenschaften konnten mit der Sekundärstruktur-Zusammensetzung korreliert werden. Aus Zugversuchen, DMA sowie einer Kombination aus linearer Zugbelastung und gleichzeitiger FTIR-Analyse konnte geschlossen werden, dass das verwendete Lösungsmittel nicht nur die Zusammensetzung der Sekundärstruktur beeinflusst, sondern auch die Vernetzung/Anordnung der einzelnen Strukturelemente. Dieser Einfluss überdauerte auch die Nachbehandlung der Filme. Alle untersuchten Nachbehandlungsarten führten zu einer Erhöhung des beta-Faltblattanteils. Allerdings konnte ein Effekt der gewählten Methode auf die Oberflächenbeschaffenheit der nachbehandelten Filme festgestellt werden: Die jeweiligen Filme unterschieden sich sowohl in ihrer Topographie als auch in ihrer Hydrophobizität. Für viele Anwendungen sind zusätzliche Funktionalisierungen vorteilhaft. Hierfür wurde die Methode der post-translationalen chemischen Kopplung gewählt.Um eine chemisch spezifische Reaktionsstelle bereitzustellen, wurden Cystein-Mutanten des Proteins eADF4(C16) hergestellt. Drei verschiedene Proteinvarianten wurden gereinigt und charakterisiert. Die Untersuchung ihrer Sekundärstruktur in Lösung und in assemblierten Filmen ergab keine signifikanten Änderungen im Vergleich zu dem Cystein-freien eADF4(C16). Zusätzlich konnten die Proteine sowohl in Lösung als auch nach Filmbildung in einer spezifischen Reaktion mit hoher Effizienz modifiziert werden. Um die Variabilität der Funktionalisierung zu zeigen, wurde die kovalente Kopplung von Fluorescein, Biotin und Nanogold durchgeführt. Des Weiteren konnte das Enzym Galaktosidase unter Beibehaltung seiner Aktivität immobilisiert werden. Für spätere Zellkulturanalysen wurde zudem eine RGD-Sequenz in Form eines zyklischen Peptids gekoppelt, die eine Integrin-vermittelte Zelladhäsion ermöglicht. Im Hinblick auf potentielle Anwendungen der rekombinanten Spinnenseidenfilme als Beschichtung wurden die Oberflächeneigenschaften der jeweiligen Filme analysiert. Dabei zeigte sich, dass besonders die Benetzbarkeit bzw. Hydrophobizität der Filmoberfläche in Abhängigkeit des verwendeten Substrats variierte. Auf hydrophoben Materialien (Polystyrol und Teflon) wiesen dünne Filme eine hydrophile Oberfläche auf, während Filme auf Glas hydrophobe Eigenschaften zeigten. Gleichzeitig konnten Unterschiede in der Sekundärstruktur der Filme nachgewiesen werden. In Anlehnung an Theorien für Block-Copolymere wurde ein Modell über eine mögliche Anordnung der Strukturelemente in diesen Filmen aufgestellt, um die beobachteten Oberflächeneffekte zu erklären. Natürliche Seidenmaterialien stellen aufgrund ihrer guten Biokompatibilität und ihrer biologischen Abbaubarkeit auch interessante Kandidaten für biomedizinische Applikationen dar. Daher wurde die biologische Verträglichkeit der rekombinanten Spinnenseidenfilme in vitro untersucht. Erste Ergebnisse ergaben eine gute Verträglichkeit des Materials; so adhärierten Prä-Osteoblasten (MC3T3-E1) auf den Filmen und konnten über mehrere Tage kultiviert werden. Das verwendete Lösungsmittel und die Nachbehandlungsart beeinflussten signifikant das Resultat, was möglicherweise auf die unterschiedliche Oberflächenchemie und -topographie zurückzuführen ist. Während die Adhäsion der Zellen auf nicht-modifizierten Filmen schwach war, konnte diese durch Kopplung der spezifischen Zelladhäsions-Sequenz c(RGDfK)verbessert werden.
-
Inter- und intramolekulare Assoziationsreaktionen als zentrale Prozesse im Verlauf der Faltung und Stabilisierung von Proteinen
(2012)
-
Stephanie Hoffmann-Thoms
- Für die Infektion von E. coli Zellen benötigt der filamentöse Phage fd sein aus drei Domänen bestehendes Gen-3-Protein (G3P). Die C-terminale Domäne verankert das G3P in der Phagenhülle, die N-terminalen Domänen N1 und N2 vermitteln die initialen Schritte der Infektion. Im Ruhezustand des Phagen liegen N1 und N2 in assoziierter Form vor, wodurch die Bindungsfläche auf der N1-Domäne für den sekundären Rezeptor, die C-terminale Domäne von TolA, blockiert wird. Zur Aktivierung des G3P interagiert der Phage über seine N2-Domäne mit dem F-Pilus der Wirtszelle wodurch die für die Assoziation der Domänen wichtige Gelenkregion entfaltet und das dort befindliche Pro213 in die trans-Konformation übergeht. Die Lebenszeit des aktiven Zustandes wird limitiert durch die Reisomerisierung von Pro213, die jedoch sehr langsam abläuft. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche Bereiche für die Population des offenen bzw. geschlossenen Zustandes und damit die Funktionalität des G3P wichtig sind. Über die Analyse des Faltungsmechanismus des Wildtyp G3P, sowie der Stabilität und Struktur seines Intermediates mittels NMR-Spektroskopie, konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in der aktiven Form komplett entfaltet vorliegt. In der Variante G3P IIHY, die unter anderem in der Gelenkregion zwei stabilisierende Substitutionen enthält, sind dagegen die Domänen im Intermediatszustand noch lose miteinander assoziiert. Die Unterschiede in der Stärke der Domänenassoziation beeinflussen die Wechselwirkung der entsprechenden G3P-Varianten mit TolAC, was in vitro anhand von Bindungsexperimenten nachgewiesen werden konnte. Sowohl im aktiven Intermediat, als auch in der nativen Form führen stabilisierende Austausche zu einer deutlichen Verschlechterung der Interaktionsfähigkeit des G3P mit TolAC. Dies wurde zusätzlich durch Infektionsexperimente sowohl mit pilusfreien, als auch mit pilushaltigen Zellen bestätigt. Die Analyse der Stabilität und des Faltungsmechanismus der P213G-Variante des fd G3P zeigt, dass auch Pro213 die Stabilität des inaktiven Ruhezustandes und damit die Lebensdauer der aktiven Form beeinflusst. Aufgrund des Verlustes des Prolinschalters liegt das entsprechende G3P P213G zum großen Teil in nicht assoziierter und damit instabiler Form vor. Durch den Austausch der beiden zu Pro213 benachbarten Reste sind die N-terminalen Domänen ebenfalls fast vollständig unabhängig voneinander, was unter anderem auf die beschleunigte Isomerisierung an Pro213 zurückgeführt werden kann. Um zu analysieren, welche Bereiche des G3P an der Weiterleitung des Signals der Bindung von N2 an den Pilus beteiligt sind, wurden verschiedene Substitutionsvarianten hergestellt, thermodynamisch charakterisiert und die Infektiositäten der entsprechenden Phagenvarianten untersucht. Dabei zeigte sich, dass die erste Schleife der N1-Domäne, die sich in der Interaktionsfläche zur N2-Domäne befindet, eine wichtige Rolle spielt. Nach Ersatz durch eine kürzere Schleife liegen N1 und N2 fast vollständig dissoziiert vor, wie unter anderem aus der Analyse der Affinität gegenüber TolAC sowohl in vitro als auch in vivo hervorgeht. Während der Aktivierung müssen im Umkehrschluss auch die Wechselwirkungen zwischen der Schleifenregion von N1 und N2 gelöst werden. Aufgrund der hohen Stabilität seines G3P im Ruhezustand wird der fd Phage als Grundlage des PROSIDE-Selektionsverfahrens verwendet, um stabilisierte Proteinvarianten zu erhalten. Für das Gb1-Protein aus Streptococcus sp. wurden darüber unter anderem vier stark stabilisierende hydrophobe Austausche identifiziert, die in der Variante Gb1-M2 kombiniert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Stabilität dieser hyperstabilen Variante näher analysiert. Die relativ zum WT-Gb1 deutlich erhöhte Stabilität von Gb1-M2 ist dabei zum Teil durch deren Dimerisierung bedingt. Die Kristallstruktur des Proteins zeigt, dass die Assoziation der Monomere über die Ausbildung eines intermolekularen b-Faltblattes und eine hydrophobe Interaktionsfläche vermittelt wird. Der Kern dieser Assoziationsfläche wird durch Leucinreste an den Positionen 16 und 37 gebildet. Die Untersuchung weiterer Varianten hat gezeigt, dass die Kombination von hydrophoben Resten an diesen Positionen zur Dimersierung führt. Um den Beitrag der Austausche zur konformationellen Stabilität des Monomers von Gb1-M2 zu bestimmen, wurde dessen Faltungsmechanismus mittels Einzel- und Doppelmischexperimenten analysiert. Die Faltung des Monomers konnte dabei von der Einstellung des Monomer-Dimer-Gleichgewichtes getrennt und seine Stabilität bestimmt werden. Diese ist gegenüber dem WT-Gb1 deutlich erhöht. Eine solche kinetische Analyse kann allgemein für oligomere Proteine verwendet werden, um die Stabilität ihrer monomeren Form zu ermitteln. Voraussetzung ist, dass, wie in Gb1-M2, die Faltung des Monomers schneller abläuft als die Einstellung des Monomer-Oligomer-Gleichgewichtes.
