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Analyse von Condensin-Komplexen in Drosophila melanogaster Charakterisierung der Untereinheit CapG und Identifizierung von Interaktionen
(2012)
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Sabine Herzog
- Die akkurate Verteilung der Chromosomen während der Mitose ist essentiell für die genetische Stabilität der Zellen. Der heteropentamere Condensin-Komplex ist hierbei an der Strukturierung der Chromosomen und deren physikalischer Stabilität während der Segregation maßgeblich beteiligt. In höheren Eukaryoten konnten zwei dieser Komplexe (Condensin I und Condensin II) identifiziert werden, die ihrerseits eine distinkte subzelluläre Lokalisation während der Interphase und auch Beladung an das mitotische Chromatin aufweisen. Die beiden Komplexe haben die Structural maintenance of chromosomes (SMC) Untereinheiten SMC2 und SMC4 gemein, während sie sich in den nicht-SMC-Untereinheiten unterscheiden: In Condensin I findet man die Komponenten Chromosome associated protein D2 (CapD2), CapG und CapH und in Condensin II die verwandten Proteine CapD3, CapG2 und CapH2. Während in Vertebraten die Rolle beider Condensin-Komplexe während der Mitose klar etabliert ist, zeichnet sich in Drosophila melanogaster ein anderes Bild ab. Mutanten in den Genen CapH2 und CapD3 zeigen keine mitotischen Phänotypen und ein zu CapG2 homologes Protein konnte bisher nicht identifiziert werden. Da CapG aus Drosophila ein ähnliches Lokalisationsverhalten wie die Condensin II-Untereinheiten der Vertebraten aufweist, wird CapG als Komponente beider Condensin-Komplexe diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktion und die Regulation von CapG in Drosophila melanogaster, primär durch die Analyse von EGFP-fusionierten Proteinvarianten, näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von CapG neben den hauptsächlichen Phosphorylierungsstellen auch Kernimportsequenzen enthält, welche die subzelluläre Lokalisation des Proteins während des Zellzyklus regulieren. Während der Interphase zeigt CapG im Zellkern eine Kolokalisation mit dem Heterochromatin-bindenden Protein HP1, was auf eine direkte Chromatinassoziation von CapG hinweist und mögliche Chromatin-strukturierende Funktionen bestätigen würde. Diese Heterochromatin-spezifische Lokalisation kann vom C-terminalen Drittel von Cap-G vermittelt werden, der andererseits für die generelle Chromatinassoziation während der Mitose, die Interaktion mit den anderen Condensin I-Untereinheiten und für die Funktionalität von CapG während der somatischen Mitosen entbehrlich ist. Da ein Proteinfragment entsprechend der N-terminalen Zwei-Drittel von CapG (CapG-NM) während der Interphase hauptsächlich zytoplasmatisch lokalisiert ist, kann die präferentielle Kernlokalisation von CapG während der Interphase, und auch die Phospho-Regulation des Proteins, für die Entwicklung vom Beginn der embryonalen zygotischen Expression bis hin zum adulten Stadium nicht essentiell sein. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Lokalisation von CapG und anderen Condensin Untereinheiten in Geweben der weiblichen und männlichen Keimbahn legt die Vermutung nahe, dass CapG, eventuell im Kontext mit den anderen Condensin-Untereinheiten, eine Rolle bei der Gametogenese zukommt. Konsistent hiermit ist die Beobachtung, dass Weibchen steril sind, die in ihren Keimbahnzellen keine funktionelle CapG-Variante exprimieren. Die Integrität der Ovarien in diesen Tieren spricht für eine Funktion von CapG bei der Reifung des Oozytenkerns oder den meiotischen Teilungen. Die Präsenz von CapG in löslichen Komplexen mit den bekannten Condensin I-Untereinheiten konnte in dieser Arbeit durch Koimmunpräzipitationen mit nachfolgender massenspektroskopischer Bestimmung der assoziierten Proteine bestätigt werden. Eine Assoziation mit Condensin II-spezifischen Untereinheiten wurde dagegen nicht gefunden. Ebenso assembliert eine ektopisch exprimierte, funktionelle Variante von CapH2 nicht in einem löslichen Komplex mit CapG. Auch die Analyse direkter Protein-Protein-Interaktionen in einem in vitro-System ergab keine Hinweise auf eine Assoziation von CapG mit Condensin II-spezifischen Untereinheiten. Dagegen konnten in diesem System die Interaktionen nachvollzogen werden, die für Condensin I und Condensin II aus anderen Systemen publiziert und somit erwartet sind. Experimente zur genetischen Interaktion der Condensin-Untereinheiten offenbarten bei Anwesenheit von CapG-Mutationen eine Suppression des Phänotyps, der nach Überexpression von CapH2 in Speicheldrüsen erhalten wird. In einem reziproken Ansatz führten CapG-Mutationen zu einer Verstärkung des CapH2-mutanten Phänotyps in den Nährzellen von Ovarien. CapH2 und CapG scheinen also auf genetischer Ebene miteinander zu interagieren. Zusammengenommen legen die Ergebnisse ein Modell nahe, in dem CapG zwar nicht in direkter Assoziation mit Condensin II-spezifischen Komponenten vorliegt, aber parallel an der Strukturierung von Chromatin beteiligt ist und funktionell zum Teil mit den Aufgaben der Condensin II-spezifischen Komponenten überlappt.
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Eukaryotic chromosome segregation: New aspects of separase regulation by securin, Cdk1, PP2A and auto-cleavage
(2011)
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Franziska Böttger
- The universal triggering event of eukaryotic chromosome segregation is the proteolytic cleavage of chromosomal cohesin by separase. The activity of this essential but potentially also very dangerous protease must be tightly controlled. Prior to the onset of anaphase separase is kept inactive by association with either securin or cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) in conjunction with cyclin B1. Only when all chromosomes interact properly with the mitotic spindle apparatus does the anaphase promoting complex or cyclosome (APC/C), a multisubunit E3 ligase, mediate the ubiquitylation of securin and cyclin B1. Their subsequent proteasomal degradation then releases active separase. Murine embryonic stem cells, which lack securin and express a Cdk1-resistant phosphorylation site mutant separase are viable. Thus, additional regulations of sister chromatid separation by separase must exist. It was reported that human separase cleaves not only cohesin but also itself and, furthermore, that it interacts with protein phosphatase 2A (PP2A). However, the functions of separase's auto-cleavage and PP2A-interaction remain enigmatic. Moreover, securin was reported to also interact with PP2A but, strangely, with a different isoform of the phosphatase. Thus, the question needs clarification of whether separase or securin or both interact with which isoform of PP2A. In this study, further insights into the relationship between separase auto-cleavage and PP2A binding are presented. Phosphorylation of a serine residue in close proximity to the major cleavage site of separase was found to stimulate auto-cleavage of separase. Interestingly, a quantitative mass-spectrometric approach (SILAC) identified this serine residue as a substrate of separase-bound PP2A. Furthermore, a point mutation within separase was identified, which totally abolishes PP2A binding and which maps to the immediate vicinity of the auto-cleavage sites. Thus, PP2A prevents the auto-cleavage of separase both catalytically and sterically. It could further be shown that non-cleavable separase exhibits increased association with PP2A and that forced cleavage of separase displaces PP2A. Taken together, these results demonstrate that auto-cleavage and PP2A binding constitute two antagonistic mechanisms of separase regulation. Evidence is provided that the interaction of PP2A with securin is indirect and bridged by separase, and that it is the B56- and not the B55-isoform of PP2A which associates with the separase-securin complex. Moreover, free securin is shown to be degraded in early mitosis in a phosphorylation- and APC/C-dependent manner, while separase-associated securin is kept dephosphorylated and, thus, protected by PP2A. Securin levels are frequently increased in tumors. In normal cells, the early removal of excessive securin might later ensure swift separase activation and anaphase onset, thereby contributing to faithful chromosome segregation.
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Chromosome dynamics during cell divisions in Drosophila melanogaster: The role of Rad21 in meiotic cohesion and dynamic analysis of the condensin subunit CapG in early embryonic mitotic divisions
(2010)
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Sonal Nagarkar
- Faithful segregation of genetic material is an essential hallmark of cell division. In eukaryotic cells, the DNA is replicated during S phase into two identical copies, which reside intimately paired (cohesed) in the nucleus as dispersed and entangled interphase chromatin fibers. At the onset of mitosis, the chromatin fibers start to resolve and by the end of metaphase they are compacted and individualized into a pair of cylindrical structures called sister chromatids, which remain connected until anaphase onset by residual sister chromatid cohesion in their centromeric regions. The compaction process is known as chromosome condensation, which is a prerequisite for accurate segregation of sister chromatids in anaphase. Chromosome condensation and sister chromatid cohesion require multisubunit protein complexes, the condensin and the cohesin complexes, respectively. Both complexes are composed of two core SMC subunits and a set of non-SMC subunits, which are conserved among most eukaryotes. In the first part of my thesis, I have analyzed the localization and dynamic behavior of a functional, EGFP-fused variant of CapG, one of the non-SMC subunits of the condensin I complex in Drosophila melanogaster. In vivo fluorescence microscopy of early embryonic mitotic divisions revealed that CapG-EGFP is mainly nuclear during interphase and that it starts to enrich at centromeric proximal regions in late interphase. Thereafter, CapG-EGFP spreads onto the chromosome arms concomitantly with the initiation of chromosome condensation (ICC) and loading is complete already in prophase at the time of nuclear envelope breakdown. Furthermore, FRAP analyses revealed that a major proportion of CapG-EGFP is stably bound to chromatin during metaphase and only a minor fraction shows a dynamic association with chromatin. These results are similar, but not identical, to findings previously obtained for another non-SMC subunit, CapH/Barren, suggesting interactions of the individual non-SMC subunits with chromatin outside a bona fide condensin complex. Since a non-SMC cohesin subunit homologous to the typical meiotic Rec8 protein found in other eukaryotes appears to be missing in Drosophila, I have assessed in the second part of my thesis a possible cohesive role for the mitotic subunit Rad21 during female meiosis. Furthermore, a potential redundancy during oogenesis between Rad21 and another candidate cohesin subunit, C(2)M, was analyzed. Forced proteolysis of Rad21 during oogenesis resulted in delocalization of the canonical cohesin core subunit Smc1 from oocyte chromatin. Furthermore, immunofluorescence and fluorescence in situ hybridization analyses revealed a high proportion of premature homolog disjunction and premature sister chromatid separation in the developing mutant oocytes and also during the meiotic divisions. Moreover, it was established that Rad21 has a role in the maintenance of the synaptonemal complex (SC), as shown by delocalization of the transversal SC component C(3)G. Taken together, these results suggest that Rad21 is indeed involved in sister chromatid cohesion during female meiosis in D. melanogaster. Since in the absence of Rad21 and the concomitant presence of C(2)M meiotic sister chromatid cohesion is compromised, Rad21 appears to play the major role in meiotic sister chromatid cohesion in D. melanogaster and a functional redundancy between C(2)M and Rad21 is unlikely.
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Identification and characterization of Sgo2 interactions - Insights into dynamic chromosomal localization, mechanism of cohesin protection and putative checkpoint function
(2010)
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Bernd Mayer
- Sister chromatids are embraced and held together by a ring-shaped multiprotein complex called cohesin, from the time of their generation in S-phase until their separation in M-phase. Shugoshins protect centromeric cohesin from premature dissociation and, hence, are important regulators of genome stability. This work demonstrates that hSgo2, one of the two shugoshins in humans, first binds to kinetochores in prophase, then localizes to centromeres in prometaphase before finally traveling back to kinetochores in metaphase. It is further shown that (1) chromatin binding requires the C-terminus of hSgo2, (2) the catalytic activity of the aurora B kinase is essential to focus hSgo2 at centromeres, and (3) attachment of microtubules to kinetochores is not only necessary for the metaphase-specific re-localization of hSgo2 but also sufficient; pulling forces are not required. These newly discovered regulations allow to formulate a mechanistic model that explains shugoshin’s dynamic subcellular localization. An existing conflict in the literature concerns the relative importance of mammalian Sgo1 and Sgo2 in mitosis. Cell biological analyses now demonstrate unambiguously that, contrary to earlier claims, hSgo2 is dispensable for several aspects of mitotic cell divisions. Thus, shugoshin functions are strictly separated, being fulfilled by hSgo1 in mitosis and by hSgo2 in meiosis. Initially, it was unclear how shugoshins exert their cohesin protective function at the molecular level. Using a biochemical approach, protein phosphatase 2A (PP2A) was identified as a prominent interactor of shugoshins in this thesis. Shortly thereafter, it was reported that shugoshins protect cohesin by mediating PP2A-dependent dephosphorylation. Nevertheless, it is shown here for the first time that hSgo2 binds PP2A via its N-terminus. A Sgo2 point mutant deficient in PP2A binding is created and characterized by cell biological experiments. Importantly, biochemical assays demonstrate that hSgo2 greatly stimulates PP2A’s enzymatic activity. Shugoshin function therefore extends beyond simple provision of a linkage between cohesin and PP2A. Mitosis and meiosis are chiefly controlled by the spindle assembly checkpoint (SAC), which allows anaphase to take place only after all chromosomes have become properly attached to the mitotic spindle. Central to SAC signaling, kinetochore bound Mad1-Mad2 complex catalyzes a conformational switch of soluble Mad2, thereby allowing its inhibitory binding to the downstream effector protein Cdc20. SAC-dependent inhibition of anaphase correlates well in timing with shugoshin-dependent protection of cohesin. Here, Mad2 is identified as another novel interactor of hSgo2. Precise mapping reveal a conserved Mad2 interaction motif (MIM) in hSgo2, which is shared by the known Mad2 interactors Mad1 and Cdc20. In fact, several lines of evidence show that the Sgo2-Mad2 complex is structurally very similar to the Mad1-Mad2 and the Cdc20-Mad2 complexes. These biochemical studies challenge the current “one source (kinetochore bound Mad1) – one target (Cdc20)” dogma in the field of SAC research. Mad2 binding is conserved in the only Xenopus laevis shugoshin, xSgo1, indicating an important function of this interaction during vertebrate meiosis.
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Zellteilungsregulation meristematischer Wurzelzellen (Tabak BY-2) durch Phytohormone und Zucker
(2005)
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Katja Hartig
- Die Phytohormone Cytokinin und Auxin sind essentiell für die Zellteilungsaktivität in meristematischen Geweben. Trotz ihrer zentralen Bedeutung im pflanzlichen Zellzyklus, ist über deren Bedeutung und Wirksamkeit auf molekularer Ebene bisher nur wenig bekannt. Einige Untersuchungen deuten darauf hin, dass mit Hilfe hormoneller Signale die Zellteilungsaktivität der Meristeme an die physiologischen Gegebenheiten der gesamten Pflanze angepasst wird, und auf diese Weise der Verbrauch an Zucker, die sogenannte Sinkstärke des Meristems definiert wird. Besonders bedeutsam ist deshalb der "cross-talk" der hormonellen Signale mit den metabolischen Signalen. Da diese Signalverknüpfung bisher kaum Ziel wissenschaftlicher Untersuchungen war, sollte diese Arbeit zur Aufklärung betragen. Die Untersuchungen wurden mit einer Tabak Zellkultur (BY-2) durchgeführt, die als Modell eines Wurzelmeristems dienen sollte. Ein Vorteil dieser Zellkultur ist die Möglichkeit, den Zellzyklus der Zellen durch auswaschbare Hemmstoffe synchronisieren zu können. Diese Synchronisierung eröffnet die Möglichkeit, die Effekte von Cytokininen, Auxinen und Zucker auf den Ablauf des Zellzyklus mittels Durchflusscytometrie untersuchen zu können, in dem Qualität und Quantität dieser Faktoren variiert wurde. Parallel dazu wurde die Expression von Zellzyklus-Kontrollgenen mittels semiquantitativer RT-PCR analysiert und entsprechend responsive Gene identifiziert. Ergänzt wurden die Untersuchen der Regulation des Zellzyklus durch längerfristige Beobachtungen der Entwicklung der Zellzahl, des Frischgewichtes und des Volumens der Zellen. Zur Charakterisierung der Signalentstehung, wurden die extrazellulären und intrazellulären Konzentrationen der die Zellteilung steuernden Faktoren gemessen.
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Die Funktion von Three rows bei der Schwesterchromatiden-Trennung in Drosophila melanogaster
(2003)
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Alf Herzig
- In der Mitose werden die Schwesterchromatiden getrennt und auf beide Tochterzellen verteilt. Die Trennung der Schwesterchromatiden erfordert die proteolytische Spaltung des Scc1-Proteins. Scc1 ist Bestandteil des Kohäsin-Komplexes, der die Schwesterchromatiden nach ihrer Entstehung in der S-Phase bis zum Beginn der Anaphase gepaart hält. Die Protease, die durch Scc1-Spaltung die Schwesterchromatiden-Trennung einleitet, heißt Separase. Die Separase wird erst dann aktiviert, wenn alle Chromosomen bipolar mit dem mitotischen Spindelapparat verbunden sind. Die Aktivierung der Separase erfordert die Ubiquitinabhängige Degradation des Securins, einer inhibitorischen Untereinheit der Separase. Weitere Mechanismen der Separase-Regulation sind noch nicht vollständig verstanden. Das Securin von Drosophila melanogaster ist das Protein Pimples (PIM). Die Separase (SSE) von D. melanogaster besitzt zwar eine Protease-Domäne, aber die N-terminale regulatorische Domäne, die in Separasen anderer Eukaryoten gefunden wird, fehlt in SSE fast vollständig. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PIM und SSE einen heterotrimeren Komplex mit dem Protein Three rows (THR) bilden. THR besitzt Bindungsstellen für PIM und SSE. In anderen Organismen besitzt die N-terminale Separase-Domäne Bindungsstellen für das Securin und die Protease-Domäne der Separase. Diese Ergebnisse legen nahe, dass THR strukturell der N-terminalen Domäne anderer Separasen entspricht. Die Separase aus D. melanogaster scheint demnach aus zwei Untereinheiten aufgebaut zu sein. Während SSE die katalytische Domäne der Separase beinhaltet, wurde hier gezeigt, dass THR eine regulatorische Separase-Untereinheit ist. THR wird nach dem Metaphasen-Anaphasen-Übergang proteolytisch gespalten. Diese Spaltung erfolgt nur in funktionellen Separase-Komplexen, und die Spaltstelle in THR entspricht dem Konsensus einer Separase-Spaltstelle. Mutationen in dieser Spaltstelle unterbinden die THR-Spaltung. Diese Daten legen nahe, dass THR durch die katalytische Untereinheit der Separase gespalten wird. Die Expression von nicht spaltbaren THR-Varianten führt zu frühembryonaler Letalität bei erniedrigter Temperatur. Diese Letalität wird unterdrückt, wenn die katalytische Aktivität der Separase erniedrigt wird. Die Spaltung von THR trägt demnach zur Inaktivierung der Separase bei. Die Spaltung von THR ist vor allem während der Zellularisierung wichtig, einem insektenspezifischen Prozess in der Embryonalentwicklung von D. melanogaster. Während der Zellularisierung führt die ausbleibende Inaktivierung der Separase zu Defekten im Tubulin-Zytoskelett. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Separase in D. melanogaster weitere Substrate neben den Kohäsinen und andere Funktionen als in der Schwesterchromatiden-Trennung hat.
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Funktion und Regulation von D- und E-Typ-Cyclin-Cdk-Komplexen während der Entwicklung von Drosophila
(2002)
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Claas Aiko Meyer
- In dem vorliegenden Dokument werden 3 Originalarbeiten (s. S. 35) zusammengefasst. Die Embryonalentwicklung eines Vielzellers beginnt im allgemeinen mit einer Pha-se exponentieller Zellproliferation. Anschließend erfolgt in den meisten Zellen ein Zellproliferationsarrest und die terminale Zelldifferenzierung. Hierbei muss das Ausmaß der Zellproliferation mit anderen Entwicklungsvorgängen wie Musterbil-dung und Wachstum abgestimmt werden. Der G1/S-Übergang im Zellzyklus ist ein wichtiger Kontrollpunkt für die Zellproliferation. Hier wird in der Zelle entschieden, ob die DNA in einer S-Phase repliziert und ein weiterer Zellteilungszyklus durchlaufen wird. Die Aktivität von Cyclin E-Cdk(Cyclin-dependent kinase)2-Proteinkomplexen ist essentiell für den Eintritt in die S-Phase. Umgekehrt erfordert der Austritt aus der Zellproliferation zum korrekten Zeitpunkt in der Entwicklung die Inaktivierung von Cyclin E-Cdk2-Komplexen. Es wird allgemein angenommen, dass Cyclin E-Cdk2-Komplexe durch Cyclin D-Cdk4-Komplexe reguliert werden. So phosphorylieren Cyclin D-abhängige Kina-sen das Retinoblastoma-Protein Rb, wodurch die Repression von Klasse I-Zielgenen des Rb-Signalwegs, wie Cyclin E, beendet wird. Anschließend kommt es infolge der Cyclin E-Aktivierung zur Hyperphosphorylierung von Rb durch Cyc-lin E-Cdk2-Komplexe. Dies bewirkt die Freisetzung und Aktivierung von E2F-Transkriptionsfaktoren, welche die Expression von S-Phasen-Genen kontrollieren. Um die funktionelle Bedeutung von Cyclin D-Cdk4-Komplexen während der Entwicklung zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit eine Cdk4-Nullmutation in Drosophila melanogaster charakterisiert. Überraschenderweise entwickeln sich adulte Fliegen auch in Abwesenheit jeglicher Cdk4-Funktion. Cdk4-Mutanten sind allerdings von reduzierter Größe und eingeschränkter Fertilität. Cdk4 ist daher nicht essentiell für die Zellproliferation. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass Cyclin D-Cdk4-Komplexe eine wachstumsstimulatorische Funktion besitzen und für das Wachstum sowohl der einzelnen Zelle als auch des gesamten Organismus benötigt werden. Konditionale Überexpression von Cyclin D und Cdk4 zeigt, dass Cyclin D-Cdk4-Komplexe im Rb-Signalweg wirken und unabhängig von Cyclin E die Transkription von RnrS in physiologischer Stärke induzieren. RnrS kodiert für die kleine Untereinheit der Ribonukleotidreduktase und ist ein bekanntes Zielgen von E2F-Transkriptionsfaktoren. Die Überexpression von Cyclin D-Cdk4 in der embry-onalen Epidermis kann jedoch den rechtzeitigen Austritt aus dem Zellzyklus nicht verhindern. Cyclin D-Cdk4-Komplexe sind daher keine Entscheidungsträger über Ein- und Austritt aus der Zellproliferation. Im Gegensatz zu Cyclin D-Cdk4-Komplexen müssen Cyclin E-Cdk2-Komplexe inhibiert werden, um einen rechtzeitigen Zellproliferationsarrest sicher-zustellen. Für die rechtzeitige Inhibition wird beginnend in der G2-Phase vor der terminalen Mitose das dacapo(dap)-Gen exprimiert. DAP-Protein bindet an Cyclin E-Cdk2-Komplexe und inhibiert diese. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Mechanismen die embryonale Ex-pression von dap und damit den Austritt aus dem Zellzyklus steuern. Die Analyse verschiedener Mutanten hat gezeigt, dass dap-Expression auch unabhängig vom vollständigen Ablauf des Zellproliferationsprogramms direkt durch Zellschicksals-determinanten reguliert wird. Eine Analyse der genomischen 5´-Kontrollregion von dap mit Hilfe von Deletions- und Reporterkonstrukten ergab, dass die Expression von dap in verschiedenen Geweben durch unabhängige Enhancermodule gesteu-ert wird. An einem dieser Enhancer wirkt der HOX-Transkriptionsfaktor Abdominal B (ABD-B), der eine zentrale Bedeutung für die Spezifizierung von Entwicklungs-schicksalen besitzt. Die 5´-Kontrollregion von dap spielt daher eine wichtige Rolle bei der Koordination von Entwicklungschicksal und Zellproliferation.
