Investigations on the Reaction Mechanism of Xenobiotic Reductase A

Untersuchung des Reaktionsmechanismus der Xenobiotika Reduktase A

Xenobiotic reductase A (XenA) from Pseudomonas putida 86 is a member of the Old Yellow Enzyme family of FMN containing enzymes. It catalyzes the NADH/NADPH dependent reduction of various substrates, including 2-cyclohexenone, coumarin, 7- and 8-hydroxycoumarin in a two-step mechanism consisting of a reductive and an oxidative half-reaction. The overall structure of the family members is similar but the active site residues show considerable variations. One distinct difference of XenA compared toXenobiotic reductase A (XenA) from Pseudomonas putida 86 is a member of the Old Yellow Enzyme family of FMN containing enzymes. It catalyzes the NADH/NADPH dependent reduction of various substrates, including 2-cyclohexenone, coumarin, 7- and 8-hydroxycoumarin in a two-step mechanism consisting of a reductive and an oxidative half-reaction. The overall structure of the family members is similar but the active site residues show considerable variations. One distinct difference of XenA compared to other members is the presence of a cysteine residue (Cys25) in the active site, where most other members have a threonine. Further, the active site of XenA is lined up by two tyrosine (Tyr27 and Tyr183) and two tryptophan (Trp302 and Trp358) residues. To get a better understanding of the reaction mechanism of XenA we analyzed the enzyme using a combination of transient and steady-state kinetics, redox potentiometry and crystal structure analysis. Thermodynamic and kinetic investigations revealed a preference of XenA for NADPH over NADH. Furthermore, the reaction catalyzed by XenA follows a ping-pong mechanism in which both substrates are bound to the same position in the active site but interact with different amino acids. The crystal structures of XenA without and with coumarin bound to the active site were solved at true atomic resolution. The oxidized complex with coumarin showed a compressed active site geometry in which the isoalloxazine ring of FMN is sandwiched between coumarin and the protein backbone. The crystal structure of reduced XenA showed a distortion of the isoalloxazine ring and the movement of Trp302 into the active site. Furthermore, we analyzed the individual contributions of the five active site residues using site-directed mutagenesis. An exchange of Cys25 against serine shifted the reduction potential of the FMN/FMNH- couple by 82 mV, increased the limiting rate constant of the reductive and decreased the limiting rate constant of the oxidative half-reaction. Therefore we conclude that Cys25 modulates substrate binding and the reduction potential of FMN. Moreover, we revealed that Tyr27 contributes to the stabilization of the transition state during the reductive half-reaction by an interaction of its hydroxyl group with the transferred hydride ion. The exchange of Tyr183 resulted in a decreased affinity of XenA for NADPH and a considerable decrease of the rate of the oxidative half-reaction. These results are in agreement with its function as indispensable proton donor in the oxidative half-reaction. Exchanging Trp302 resulted in multiphasic kinetics for both half-reactions and a decreased affinity of XenA for NADPH. In combination with its movement between the reduced and oxidized state of XenA, we propose a redox dependent shaping of the active site by Trp302. Hence, this residue is responsible for the correct positioning of the substrates in both half-reactions, which is an essential part in the reaction mechanism. The results from the exchange of Trp358 indicated that this residue is involved in the orientation of the nicotinamide ring of NAD(P)H by spatial exclusion. Crystal structures of enzyme substrate complexes are usually determined from non-reactive states. The Y183F variant of XenA, lacking the proton donor of the oxidative half-reaction, allowed us to freeze-trap the true Michaelis complexes of reduced XenA in complex with four different substrates. For the first time we were able to observe 2-cyclohexenone in an active site. Finally, we prove that mode of substrate binding of XenA is redox dependent. In summary our results provide a more detailed description of the reaction mechanism of XenA and offer new insights on how substrates interact with flavoenzymes.show moreshow less
Die Xenobiotika-Reduktase A (XenA) aus Pseudomonas putida 86 gehört zur Familie der FMN enthaltenden Old Yellow Enzyme Familie. In einem zweistufigen Mechanismus, der sich in eine reduktive und eine oxidative Halbreaktion gliedert, reduziert es in Abhängigkeit von NADH bzw. NADPH verschiedene Substrate wie beispielweise 2-Cyclohexenon, Cumarin, 7- und 8-Hydroxycumarin. Obwohl innerhalb der Familie die Proteinstrukturen sehr ähnlich sind, finden sich deutliche Unterschiede im aktiven Zentrum. AufDie Xenobiotika-Reduktase A (XenA) aus Pseudomonas putida 86 gehört zur Familie der FMN enthaltenden Old Yellow Enzyme Familie. In einem zweistufigen Mechanismus, der sich in eine reduktive und eine oxidative Halbreaktion gliedert, reduziert es in Abhängigkeit von NADH bzw. NADPH verschiedene Substrate wie beispielweise 2-Cyclohexenon, Cumarin, 7- und 8-Hydroxycumarin. Obwohl innerhalb der Familie die Proteinstrukturen sehr ähnlich sind, finden sich deutliche Unterschiede im aktiven Zentrum. Auffällig bei XenA ist, dass ein weitgehend konserviertes Threonin durch ein Cystein ersetzt ist (Cys25). Darüber hinaus befinden sich im aktiven Zentrum von XenA zwei Tyrosine (Tyr27 und Tyr183) und zwei Tryptophane (Trp302 und Trp358). Um ein besseres Verständnis des Reaktionsmechanismus zu erhalten, wurde XenA in dieser Arbeit durch eine Kombination aus transienten und steady-state kinetischen Methoden, sowie Redoxpotentiometrie und Kristallstrukturanalyse untersucht. Durch thermodynamische und kinetische Messungen zeigte sich dabei, dass XenA NADPH gegenüber NADH als Substrat bevorzugt. Zudem folgt die durch XenA katalysierte Reaktion einem Ping-Pong Mechanismus. Bei diesem binden beide Substrate an der selben Stelle im aktiven Zentrum, aber interagieren dort mit verschiedenen Aminosäuren. Des Weiteren wurden die Kristallstrukturen von XenA mit und ohne Cumarin im aktiven Zentrum bei atomarer Auflösung bestimmt. Im oxidierten Zustand des Komplexes befindet sich der Isoalloxazinring des FMN zwischen Cumarin und Proteinrückgrat, wodurch das aktive Zentrum gestaucht wird. In der Kristallstruktur von reduzierter XenA läßt sich eine Verzerrung des Isoalloxazinringes und eine Bewegung von Trp302 ins aktive Zentrum hinein beobachten. Mit Hilfe von ortsgerichteter Mutagenese wurden zudem die fünf Reste des aktiven Zentrums untersucht. Der Austausch von Cys25 gegen Serin verschob das Redoxpotential zwischen FMN und FMNH- um 82 mV, erhöhte die maximale Geschwindigkeitskonstante der reduktiven und erniedrigte die maximale Geschwindigkeitskonstante der oxidativen Halbreaktion. Dies bedeutet, dass Cys25 die Bindung und das Redoxpotential von FMN moduliert. Außerdem konnten wir Tyr27 als Stabilisator des Übergangszustandes während der reduktiven Halbreaktion identifizieren, in welchem die Hydroxylgruppe des Tyrosins mit dem übergehenden Hydridion interagieren kann. Ein Austausch des Tyr183 hingegen hatte eine erniedrigte Affinität von XenA gegenüber NADPH und eine deutlich verringerte Rate der oxidativen Halbreaktion zur Folge. Daraus läßt sich folgern, dass es sich bei Tyr183 um den essentiellen Protonendonor innerhalb der oxidativen Halbreaktion handelt. Nach der Auswechslung von Trp302 wiesen die Kinetiken beider Halbreaktionen multiple Phasen auf und die Affinität von XenA gegenüber NADPH sank. Da dieser Rest zudem unterschiedliche Positionen im reduzierten und oxidierten Zustand von XenA einnimmt, folgern wir, dass Trp302 in Abhängigkeit des Redoxzustandes die Form und Zugänglichkeit des aktiven Zentrums variiert. Dadurch können die Substrate für die jeweilige Halbreaktion richtig positioniert werden. Dies ist von außerordentlicher Bedeutung für den Reaktionsmechanismus. Ferner konnte gezeigt werden, dass Trp358 eine Rolle bei der korrekten Orientierung des Nicotinamidrings von NAD(P)H spielt. Üblicherweise werden Kristallstrukturen von Enzym-Substrat-Komplexen in unreaktiven Zuständen gemessen. Da bei der Y183F Variante der Protonendonor der oxidativen Halbreaktion entfernt wurde, konnten die Strukturen der Michaelis Komplexe von reduzierter XenA mit vier verschiedenen Substraten bestimmt werden. Dabei gelang es zum ersten Mal 2-Cyclohexenon im aktiven Zentrum eines Proteins zu beobachten. Schließlich beweisen wir durch diese Strukturen die redoxabhängige Substratbindung von XenA.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Olivia Spiegelhauer
Advisor:Prof. Dr. Holger Dobbek
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:21.07.2010
Year of Completion:2010
SWD-Keyword:Cumarin; NADH; NADPH; Pseudomonas putida
Tag:2-Cyclohexenon; FMN; Michaelis Komplex; Ping-Pong Mechanismus; Xenobiotika Reduktase A
TIM-barrel; flavin; old yellow enzyme; stopped-flow; xenobiotic reductase A
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-7228
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):17.08.2010