Das Gen-3-Protein filamentöser Phagen als Modellsystem zur Untersuchung von Proteinstabilität, Faltungsmechanismen und Prolylisomerisierung

The gene-3-protein of filamentous phage as model system for the investigation of protein stability, protein folding mechanisms and prolyl isomerization

Proteine sind die funktionstragenden Moleküle in lebenden Zellen und ihre pharmazeutische und biotechnologische Anwendung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Um ihre Funktion zu erlangen, müssen Proteine falten und die gefaltete Struktur möglichst lange beibehalten. Die Faltungsmechanismen und die Grundlagen der konformationellen Stabilität von Proteinen zu verstehen, ist daher eines der zentralen Ziele der biophysikalischen und biochemischen Forschung. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das Gen-3-PProteine sind die funktionstragenden Moleküle in lebenden Zellen und ihre pharmazeutische und biotechnologische Anwendung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Um ihre Funktion zu erlangen, müssen Proteine falten und die gefaltete Struktur möglichst lange beibehalten. Die Faltungsmechanismen und die Grundlagen der konformationellen Stabilität von Proteinen zu verstehen, ist daher eines der zentralen Ziele der biophysikalischen und biochemischen Forschung. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das Gen-3-Protein des Phagen fd. Sein Faltungsmechanismus ist aufs Engste mit seiner biologischen Funktion verknüpft, und es ist ein Modellsystem für die Untersuchung von Proteinfaltung, -stabilität und Prolylisomerisierung. Die isolierte N2-Domäne des Gen-3-Proteins im Mittelpunkt der Arbeit. Dabei zeigte sich, dass in der nativen N2-Domäne ein cis/trans-Gleichgewicht an Pro161 existiert, das entscheidend für die Stabilität und Faltung des Proteins ist. Solche Heterogenitäten an Prolinresten werden als potentiell wichtige regulatorische Schalter in biologischen Systemen diskutiert, konnten aber bislang kaum untersucht werden. Während der Faltung von N2 wird der cis-Anteil an Pro161 von 7 % im denaturierten Protein auf 89 % im nativen Protein erhöht, was einem Energieaufwand von 10 kJ mol-1, der Hälfte der insgesamt verfügbaren Konformationsenergie des nativen Protein, entspricht. Um diese Kopplung auf molekularer Ebene zu verstehen, wurde die lokale Sequenzumgebung von Pro161 systematisch variiert. In der cis-Form zeigte die Schleife um Pro161 eine definierte native Konformation. Die energetische Kopplung zwischen der cis-Form an Pro161 und den Faltblattsträngen ist dabei schon im Übergangszustand der Faltung voll ausgebildet. In der trans-Form hingegen ist die Schleife entfaltet, und es besteht keine energetische Kopplung mit dem Beta-Faltblatt. Die Beiträge der einzelnen Bereiche der N2-Domäne zur Struktur und zur Energetik des Übergangszustands der Faltung wurde mit Hilfe einer Phi-Wert-Analyse analysiert. Es sind zwar fast alle Bereiche für die Stabilität des nativen Proteins wichtig, den Faltungsprozeß hingegen bestimmt nur ein eng begrenzter Faltungsnukleus. Die trans-cis-Isomerisierung an Pro161 in der N2-Domäne lässt sich sehr gut durch Prolylisomerasen katalysieren. Um die Substratspezifität von Prolylisomerasen der FKBP-Familie untersuchen zu können, wurde eine Bibliothek von N2-Varianten mit allen natürlichen Aminosäuren vor Pro161 hergestellt. Prolylisomerasen, die nur aus einer katalytischen Domäne bestehen, zeigen für kurze Peptide und für faltende Proteine die gleiche Substratspezifität, mit einer sehr starken Präferenz für hydrophobe Reste vor Prolin. Besitzen die Prolylisomerasen zusätzlich eine Chaperondomäne, wie SlyD oder Triggerfaktor, dann ist ihre Aktivität praktisch unabhängig von der Aminosäure vor Prolin. Der Grund dafür ist, dass die enzymkinetischen Parameter der katalysierten Faltung, die Affinität und die Umsatzzahl durch die Chaperondomäne bestimmt werden. Die N2-Domäne besitzt nur eine marginale Stabilität. Deshalb wurde mit diesem Protein untersucht, inwieweit Proteine durch rationales consensus design von Beta-Turns stabilisiert werden können. Für N2 konnte durch Sequenzoptimierung von drei Beta-Turns die Stabilität tatsächlich praktisch verdoppelt werden, was die generelle Anwendbarkeit dieser Methode verdeutlicht. Interessanterweise führt diese Turnoptimierung auch zu einer sehr starken Beschleunigung der Faltung von N2, offensichtlich weil diese Beta-Turns bereits sehr früh im Faltungsprozess von Proteinen wichtig sind, da sie Bildung von nativen Interaktionen in den benachbarten Bereichen ermöglichen. Im Gen-3-Protein des Phagen fd tritt während der in-vitro-Faltung ein langlebiges Intermediat mit einem trans-Prolin213 auf. Mittels NMR-Spektroskopie wurde herausgefunden, das in diesem Intermediat die N1- und die N2-Domäne bereits ihre native chemische Verschiebung zeigen, aber die Gelenkdomäne zwischen den Domänen nur teilweise strukturiert ist. In der anschließenden Domänenassemblierungsreaktion werden als Folge der trans-cis Isomerisierung an Pro213 besonders Wasserstoffbrückenbindungen stark stabilisiert, die eine Kette zwischen der Grenzfläche von N1 und der Gelenkregion bilden. Die Ergebnisse zur Kopplung zwischen cis/trans Isomeren an Pro213 entsprechen konzeptionell dem Mechanismus an Pro161 in der N2-Domäne. Am Beispiel des Gen-3-Proteins des Phagen IKe wurde untersucht, ob alle Gen-3-Proteine filamentöser Phagen eine ähnliche Struktur und Faltungsmechanismus besitzen. Dabei zeigte sich, dass die TolA-bindenden Domänen beider Proteine strukturell und funktionell stark konserviert sind. Die jeweiligen pilusbindenden Domänen sind dagegen architektonisch komplett verschieden, da sie spezifisch an den jeweiligen Wirt adaptiert wurden. Deshalb sind vermutlich die Faltungsmechanismen dieser Mehrdomänenproteine, und damit auch die Infektionsmechanismen grundlegend verschieden.show moreshow less
Proteins are the vital molecules in living cells, and at the same time they are of increasing importance for pharmaceutical and biotechnological applications. To reach their function, these proteins have to fold and retain their native structure for a long time. Thus, the folding mechanism and the fundamentals of conformational protein stability are major objectives in biochemical and biophysical research. The focus of my work was on the gene-3-protein of the filamentous phage fd. Its folding meProteins are the vital molecules in living cells, and at the same time they are of increasing importance for pharmaceutical and biotechnological applications. To reach their function, these proteins have to fold and retain their native structure for a long time. Thus, the folding mechanism and the fundamentals of conformational protein stability are major objectives in biochemical and biophysical research. The focus of my work was on the gene-3-protein of the filamentous phage fd. Its folding mechanism is strongly interrelated with its biological function, and it is used as a model protein for the investigation of protein folding, protein stability and prolyl isomerization. In my work the isolated N2 domain of the gene-3-protein was investigated. Interestingly, the folded N2 domain exhibits a cis/trans equilibrium at Pro161 which is important for stability and folding of the protein. Heterogeneities at proline residues are discussed as potential important regulators in biological systems, but could hitherto not be studied in detail. During the folding of N2 the cis-content increases from 7 % in the unfolded protein to 89 % in the native protein, which requires the input of a folding free energy of 10 kJ mol-1. To elucidate the molecular path for this energetic coupling, the local sequence around Pro161 was systematically varied. In the cis form of Pro161 the loop shows a well ordered native structure and the energetic linkage between the cis form of Pro161 and the β-strands is fully established in transition state of folding already. In the presence of a trans-Pro161 the loop is locally unfolded and Pro161 is structurally and energetically uncoupled from the β-sheet. The contributions of the individual regions of the N2 domain for the structure and the energetics of the transition state of folding were analyzed using Phi-value analysis. All parts of the native protein are important for stability, but the folding process is determined by a locally restricted folding nucleus which. The trans-cis isomerization at Pro161 in the N2 domain is catalyzed very well by prolyl isomerases. To characterize the substrate specificity of prolyl isomerases of the FKBP family, a library of N2 variants with all natural amino acids before Pro161 was produced. Prolyl isomerases that consist of a catalytic domain only, show high substrate specificities for both peptides and proteins, with a strong preference for hydrophobic residues before proline. When the prolyl isomerases contain an additional chaperone domain, such as in the case of SlyD or trigger factor, their activity becomes independent of the amino acid before proline. The reason for this is that the enzymatic parameters of the catalyzed folding, the affinity and the turn over number are determined by the chaperone domain. The N2 domain of the phage gene-3-protein exhibits a low stability. Therefore, this protein was used to explore to which extent rational consensus design of Beta-turns can be used for stabilization. The sequence optimization of three Beta-turns in N2 virtually doubled its conformational stability, which illustrates the general applicability of this method. Interestingly, the turn optimization led to a strong acceleration of refolding of N2, apparently, because Beta-turns are important in the early steps of protein folding, since they allow the formation of native interactions in adjacent parts of the molecule. During the in-vitro folding of the gene-3-protein a persistent intermediate with a trans-Pro213 is populated. Using NMR spectroscopy we found out that, in this intermediate, the N1 and the N2 domains have native chemical shifts already, but the hinge region between these domains is only partially structured. In the subsequent domain assembly reaction hydrogen bonds were strongly stabilized that form a chain of interactions between N1 and the hinge region. The strong stabilization of a defined cluster of hydrogen bonds presumably provides the structural and energetic explanation for how the trans-cis isomerization at Pro213 controls the tight domain association in the folding of the gene-3-protein. The results on the coupling between cis/trans isomers at Pro213 are conceptually related to the mechanism of how the isomerization at Pro161 is interrelated with the conformational folding of the N2 domain. In the last part of this work, I used the gene-3-protein of the phage IKe to examine, if all gene-3-proteins of different types of filamentous phage have similar structure and folding mechanisms. The TolA binding domains of the two proteins are in fact structurally and functionally highly conserved. In contrast, the respective pilus binding domains and the domain interactions are radically different. As a consequence the folding and infection mechanisms are not conserved in the family of filamentous bacteriophages.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Roman Jakob
Advisor: Roman Jakob
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:14.08.2009
Year of Completion:2009
SWD-Keyword:Bakteriophage fd; Kristallstruktur; Proteinfaltung; Thermodynamische Stabilität
Tag:PPIasen; Prolylisomerisierung; Proteinfaltung; Proteinstabilitaet; Proteinstruktur
PPIase; prolyl isomerization; protein folding; protein stability; protein structure
Dewey Decimal Classification:500 Naturwissenschaften und Mathematik
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-6127
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):13.10.2009