Untersuchung und Charakterisierung des Lichtsammelkomplexes (LHPP) in etiolierten Pflanzen

Investigation and characterization of a light-harvesting complex (LHPP) in etiolated plants

In früheren Experimenten konnte ein hochmolekularer Lichtsammelkomplex (LHPP =Light-harvesting Protochlorophyllide-Oxidoreduktase:Protochlorophyllide complex´) aus POR (NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase)A-Zn Protopheophorbid b-NADPH- und PORB-Zn Protopheophorbid a-NADPH-Ternärkomplexen mit einer Stöchiometrie von 5:1 in vitro gebildet werden. Unter Verwendung von chemisch hergestelltem Protochlorophyllid a und b konnte nun ebenfalls ein hochmolekularer Komplex isoliert werden, welcher durcIn früheren Experimenten konnte ein hochmolekularer Lichtsammelkomplex (LHPP =Light-harvesting Protochlorophyllide-Oxidoreduktase:Protochlorophyllide complex´) aus POR (NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase)A-Zn Protopheophorbid b-NADPH- und PORB-Zn Protopheophorbid a-NADPH-Ternärkomplexen mit einer Stöchiometrie von 5:1 in vitro gebildet werden. Unter Verwendung von chemisch hergestelltem Protochlorophyllid a und b konnte nun ebenfalls ein hochmolekularer Komplex isoliert werden, welcher durch Nachweis mit POR-spezifischem Antikörper und aufgrund seiner spektroskopischen Eigenschaften als LHPP identifiziert wurde. Gleichzeitig konnte ein analoger Komplex von annähernd gleicher Molekulargewichtsgröße aus dem Prolamellarkörper von Gerstenetioplasten isoliert und durch einen POR-spezifischen Antikörper als vermutlicher LHPP-Komplex charakterisiert werden. Komplementiert mit aus dem Prolamellarkörper extrahierten Lipidmolekülen wie Galakto- und Sulfolipiden konnte für diesen Komplex gezeigt werden, dass wie auch im mutmaßlichen nativen LHPP-Komplex, photoaktives Protochlorophyllid 650/657 neben photoinaktiven Protochlorophyllid 628/632 vorliegt. Nach Belichtung mit einem 1 msec langen Weißlichtblitz stellte sich durch Fluoreszenzspektroskopie bei 77 K heraus, dass das photoaktive Protochlorophyllid 650/675 in Chlorophyllid 684/690 umgewandelt wurde, während das photoinaktive Protochlorophyllid nicht umgesetzt wurde. Ähnliche Pigmentverteilungen vor und nach der Belichtung konnten auch in dem isolierten nativen LHPP-Komplex nachgewiesen werden. Dabei wurde nur an PORB gebundenes Protochlorophyllid a zu Chlorophyllid a umgesetzt, während an PORA gebundenes Protochlorophyllid b unverändert blieb. Dieser Befund untermauert die Hypothese einer Antennenfunktion von PORA-gebundenem Protochlorophyllid b, um Lichtenergie zu sammeln, auf PORB-gebundenes Protochlorophyllid a zu übertragen und dessen Reduktion zu Chlorophyllid a zu vermitteln. Eine bedeutende Funktion in der katalytischen Reaktion von POR wird den evolutionär hochkonservierten Cysteinresten des Enzyms zugeschrieben. Für eine vertiefende Untersuchung wurden bei PORA und PORB aus Gerste durch „site-directed“ Mutagenese die jeweiligen vier Cysteinreste gegen Alanin ersetzt und deren Fähigkeit zur Pigmentbindung als auch zur Komplexierung zu LHPP geprüft. In PORB konnten von den vier existierenden Cysteinen zwei (Cys276 und Cys303) identifiziert werden, welche verschiedenartige Pigmentbindungsstellen im Enzym repräsentieren. Cys276 nimmt eine Pigmentbindungsstelle im aktiven Zentrum des Enzyms ein und wirkt bei der katalytischen Umsetzung seines Substrats, Protochlorophyllid a mit. Die zweite Pigmentbindungsstelle von PORB stellt das an der Enzymperipherie liegende Cys303 mit nur einer schwachen Wechselwirkung des mit ihm assoziierten Protochlorophyllidmoleküls dar. Dieses Cystein erwies sich als essentiell für die Interaktion der ternären POR-Protochlorophyllid-NADPH-Komplexen, ist also an der Bildung von LHPP maßgeblich beteiligt. Auch in PORA wurde von den vier im Enzym vorliegenden Cysteinresten von zweien deren Pigmentbindungsfähigkeit nachgewiesen. Es handelt sich um die Cysteinreste Cys202 und Cys229. Wiederum steht ein Rest, Cys202, für die Bindung – diesmal eines Protochlorophyllid-b-moleküls – im aktiven Zentrum des Enzyms zur Verfügung. Dennoch ist dieses Protochlorophyllid b in LHPP photoinaktiv und wird erst nach dem Zerfall von LHPP durch Belichtung zu Chlorophyllid b umgesetzt. Der andere an der Pigmentbindung beteiligte Cysteinrest Cys229 an der Peripherie des Enzyms zeigt nur eine schwache Bindungsaffinität zu Protochlorophyllid b. Die Bindung dieses Pigments an den Enzymkomplex ermöglicht jedoch erst die Bildung höhermolekularen LHPPs. Damit ist Cys229 also sowohl an dessen Genese beteiligt als auch für die funktionelle Energieübertragung durch „Fluorescence resonance energy transfer“ auf das das photoaktive Pigment enthaltende PORB-Protein verantwortlich. Die wichtige Rolle eines funktionalen LHPP-Komplexes zeigte die Untersuchung einer OEP16 Knockout Mutante von Arabidopsis thaliana auf. OEP16 wurde in Arabidopsis thaliana als Translokationskanal eines speziellen Importapparates für PORA identifiziert. Das Fehlen dieses Translokationsproteins in der Plastidenhülle beeinträchtigte nicht die Aufnahme anderer plastidärer Proteine, bedingte jedoch die Abwesenheit von PORA in Etioplasten. Dies hatte zur Folge, dass Etioplasten dieser Mutante im Vergleich zu denen von Wildtyp-Arabidopsis kein LHPP und keine Prolamellarkörper bilden, aber höhere Mengen an Protochlorophyllid akkumulieren. Damit einhergehend trugen etiolierte Mutantenkeimlinge bei anschließender Dauerbelichtung photooxidative Schäden davon und starben schließlich ab. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass LHPP große Bedeutung bei der Deetiolierung, d.h. dem Wechsel von Skotomorphogenese zu Photomorphogenese einnimmt.show moreshow less
Previous experiments have shown that a high-molecular light-harvesting aggregate, shortly called LHPP (light-harvesting protochlorophyllide-oxidoreductase:protochlorophyllide complex) could be assembled of ternary POR (NADPH:protochlorophyllide-oxidoreductase) A-Zn protopheophorbide b-NADPH- and PORB–Zn protopheophorbide a-NADPH-complexes in vitro in a stoichiometry of 5:1. These experiments were repeated with the chemically synthesized protochlorophyllide a and b (the authentic Mg-containing coPrevious experiments have shown that a high-molecular light-harvesting aggregate, shortly called LHPP (light-harvesting protochlorophyllide-oxidoreductase:protochlorophyllide complex) could be assembled of ternary POR (NADPH:protochlorophyllide-oxidoreductase) A-Zn protopheophorbide b-NADPH- and PORB–Zn protopheophorbide a-NADPH-complexes in vitro in a stoichiometry of 5:1. These experiments were repeated with the chemically synthesized protochlorophyllide a and b (the authentic Mg-containing compounds): A high molecular weight complex could be reconstituted that was identified to be LHPP because of its spectroscopic properties and by a POR-specific antibody. Furthermore, an analogous complex of approximately the same size could be isolated from the prolamellar bodies of etioplasts in barley, characterized as presumed LHPP-complex using POR-specific antibodies. Supplied with a mixture of galacto- and sulfolipids isolated from prolamellar bodies, fluorescence spectroscopy of the lipid-containing LHPP-complex at low temperature revealed the formation of photoactive protochlorophyllide 650/657 as well as photoinactive protochlorophyllide 628/632 in both the in vitro synthesized and the in vivo isolated complex. After illumination with a 1 msec flash of white light, pigment analysis was carried out using fluorescence spectroscopy at low temperature (77 K): Photoactive protochlorophyllide 650/657 was reduced to Chlorophyllide 684/690 whereas photoinactive protochlorophyllide 628/632 was unaffected. Thereby only PORB-bound protochlorophyllide a was converted to chlorophyllide a by its enzyme, whereas protochlorophyllide b remained stable. This confirmed the hypothesis of PORA-bound protochlorophyllide b to function as an antenna to harvest light and to transmit the energy onto protochlorophyllide a bound to PORB used to convert protochlorophyllide a to chlorophyllid a. The cysteine residues in POR were assumed to play an important role in enzyme catalysis, since they are evolutionary conserved from cyanobacteria to higher plants. To proof this hypothesis, the cysteine residues of barley PORA and PORB were individually exchanged by alanine using site-directed mutagenesis. The altered (heterologously) expressed proteins were investigated for their capacity in pigment binding and ability to assemble into higher molecular-mass complexes. In PORB two of the four cysteines (Cys276 and Cys303) could be identified to establish distinct pigment binding sites. Cys276 constitutes the protochlorophyllide binding site in the active site and is important for catalytic conversion of its substrate protochlorophyllide a as it could be shown by pigment analysis using fluorescence spectroscopy after flash-light illumination. The second (low affinity) binding site of PORB was identified as Cys303 and can be found on the outer surface of the enzyme. This cysteine was shown to be essential for the interaction between the POR-protochlorophyllide-NADPH-ternary complexes to result in LHPP formation. In case of PORA also two of the four cysteines were involved in pigment binding: Cys202 and Cys229. As well as in PORB, one cysteine residue (Cys202) is responsible for binding a pigment in the active site of the enzyme, although in this case the pigment is a protochlorophyllide b-molecule. Nevertheless this protochlorophyllide b remains photoinactiv in LHPP and can be photoconverted to chlorophyllide b only after disintegration of the LHPP complex (and the prolamellar bodies, respectively). Cys229, the other pigment binding site of PORA, is placed at the periphery of the enzyme and was demonstrated to have a weak interaction with protochlorophyllide b. Nevertheless, this protochlorophyllide molecule was proven to be necessary to allow the interaction of PORA/B-protochlorophyllide b/a-NADPH-ternary complexes to give rise to the LHPP complex. Therefore, Cys229 is essential for the biosynthesis of LHPP and for a functional energy transmittance by fluorescence resonance energy transfer´ (FRET) onto the photoactive PORB-bound protochlorophyllide a in LHPP. As mentioned before, PORA was a main constituent of LHPP. The uptake of this nucleus-encoded protein into the etioplast was shown to be dependent on a special import apparatus called PTC, from which OEP16 from Arabidopsis thaliana was identified to form the channel for the translocation of this protein. Lacking of OEP16 in a knockout mutant of Arabidopsis thaliana led to the absence of PORA in the etioplast but of no other proteins. As a consequence no formation of LHPP and prolamellar bodies as well as an increased content of protochlorophyllide compared to Arabidopsis wildtype etioplasts could be observed. These effects lead to an increased sensitivity of etiolated seedlings for irradiation emphasizing the role of LHPP in seedling survival when exposed to light.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Biologie
Author: Frank Buhr
Advisor:Prof. Dr. Christiane Reinbothe
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:07.05.2007
Year of Completion:2006
SWD-Keyword:Licht-Sammel-Komplex; Ortspezifische Mutagenese; Photomorphogenese; Proteintransport; Protochlorophyllid-Reductase
Tag:Chlorophyll-Biosynthese; Deetiolierung; LHPP
Chlorophyll-biosynthesis; Deetiolation; LHPP
Dewey Decimal Classification:580 Pflanzen (Botanik)
RVK - Regensburg Classification:WN 5450
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-3019
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):12.07.2007