Mechanismen molekularer Erkennung: Charakterisierung der molekularen Details der Wechselwirkungen des herpesviralen Tip-Proteins mit SH3-Domänen

Mechanisms of molecular recognition: Characterization of the molecular details of the interactions of the herpesviral Tip protein with SH3 domains

Die Wechselwirkungen des Tip-Proteins aus Herpesvirus saimiri mit der T-Zell-spezifischen Kinase Lck sind entscheidend für die Aktivierung der Kinaseaktivität und nehmen somit eine zentrale Rolle bei der T-Zell-Transformation ein. Bis heute war es weder durch Röntgenkristallografie, noch durch NMR-Spektroskopie möglich, eine hochaufgelöste Struktur des LckSH3-Tip-Komplexes zu erhalten. Eine Möglichkeit dieses Probleme zu lösen, ist die Verwendung von stärker bindenden Interaktionspartnern, die sDie Wechselwirkungen des Tip-Proteins aus Herpesvirus saimiri mit der T-Zell-spezifischen Kinase Lck sind entscheidend für die Aktivierung der Kinaseaktivität und nehmen somit eine zentrale Rolle bei der T-Zell-Transformation ein. Bis heute war es weder durch Röntgenkristallografie, noch durch NMR-Spektroskopie möglich, eine hochaufgelöste Struktur des LckSH3-Tip-Komplexes zu erhalten. Eine Möglichkeit dieses Probleme zu lösen, ist die Verwendung von stärker bindenden Interaktionspartnern, die sich oft besser für strukturelle Studien eignen. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit sowohl der Komplex von Tip mit LynSH3 charakterisiert, als auch eine Punktmutante (P17G) der LckSH3 entworfen, die eine höhere Affinität zu Tip aufweist. Die Strukturinformationen, die aus der Charakterisierung dieser Systeme erhalten werden konnten, sollten als Basis für eine zuverlässige Modellierung des LckSH3-Tip-Komplexes dienen. Analysen ergaben, dass die im Vergleich zur LckSH3 erhöhten Ligandenaffinitäten von LynSH3 und LckSH3_P17G auf unterschiedlichen Mechanismen basiert. Die im Vergleich zur wildtyp LckSH3 um nahezu eine Zehnerpotenz stärkere Bindung von LckSH3_P17G konnte durch schnellen Mischmethoden zumindest teilweise auf eine schnellere Komplexbildung zurückgeführt werden. Eine detaillierte Erklärung dieses Unterschieds auf struktureller Ebene konnte durch Moleküldynamiksimulationen des Wildtyps und der Mutante der LckSH3 erhalten werden. So korreliert die schnellere Komplexbildung der Mutante gut mit einer stärkeren Population der 'bindungsaktiven' Konformation während des Simulationszeitraums. Dabei zeichnet sich LckSH3_P17G nicht nur durch eine erhöhte konformationelle Abtastrate der 'bindungsaktiven' Konformation aufgrund gesteigerter RT-Schleifenflexibilität aus, sondern zeigt eine Zunahme der Gesamtflexibilität der SH3-Domäne im ps-s-Bereich auf. Weiterhin konnten durch die Analyse der thermischen Entfaltung mittels CD-Spektroskopie und MD-Simulationen eine globale Destabilisierung und ein veränderter Entfaltungsweg für die P17G-Mutante der LckSH3 gezeigt werden. Der LynSH3-Tip-Komplex konnte in hoher Auflösung mittels NMR-Spektroskopie bestimmt werden. Analysen der Komplexstruktur ergaben, dass nicht nur die Prolinhelix, sondern auch zusätzliche COOH-terminal flankierende Reste des Liganden an der Bindung beteiligt sind. Eine besondere Rolle nimmt dabei L186 ein. Es bindet in eine hydrophobe Tasche aus H41, W44 und F57 auf der Oberfläche der LynSH3. Ausgehend von der LynSH3-Tip-Komplexstruktur konnte unter der Einbeziehung NMR-spektroskopischer Daten der LckSH3-Tip-Wechselwirkungen ein molekulares Modell des LckSH3-Tip-Komplexes erstellt werden. Obwohl die Bindung von L186 in die hydrophobe Tasche auf der Oberfläche für beide SH3-Domänen experimentell nachgewiesen werden konnte, zeigten Fluoreszenztitrationsexperimente mit einem verkürzten Tip-Peptid, dass L186 aus Tip nur im Komplex mit LynSH3 einen signifikanten Einfluss auf die Affinität hat. Weitere Untersuchungen ergaben, dass L186 bei Bindung in die hydrophobe Tasche der LynSH3 nahezu vollständig von H41 bedeckt wird. Das Serin an strukturell ähnlicher Position in LckSH3 bedeckt hingegen nur einen kleinen Teil von L186. Die zusätzlichen Wechselwirkungen senken die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation des Komplexes, was in guter Übereinstimmung mit dem unterschiedlichen Austauschverhalten auf der NMR-Zeitskala steht. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit neben der Aufklärung der molekularen Grundlagen der Wechselwirkungen der LckSH3 mit dem herpesviralen Tip-Protein gezeigt werden, dass Affinität auch bei sehr nahe verwandten Proteinen auf unterschiedliche Weise erzielt werden kann. Weiterhin unterstreichen die Ergebnisse dieser Arbeit die Notwendigkeit der gleichzeitigen Charakterisierung der Struktur und Dynamik makromolekularer Interaktionen. Erst dieses kann zu einem detaillierteren Verständnis der Mechanismen molekularer Erkennung und darauf aufbauend zukünftig zu verlässlicheren Vorhersagen von molekularen Interaktionen führen.show moreshow less
The interaction of the herpesviral Tip protein with the T-cell specific kinase Lck is critical for kinase activation, thus playing a decisive role in T-cell transformation. Up to present, both X-Ray crystallography and NMR-spectroscopy failed to provide a high resolution structure of the LckSH3-Tip complex. One way to overcome these problems is the use of tighter binding interaction partners which are frequently more suitable for structural studies. For that reason the present study focused on tThe interaction of the herpesviral Tip protein with the T-cell specific kinase Lck is critical for kinase activation, thus playing a decisive role in T-cell transformation. Up to present, both X-Ray crystallography and NMR-spectroscopy failed to provide a high resolution structure of the LckSH3-Tip complex. One way to overcome these problems is the use of tighter binding interaction partners which are frequently more suitable for structural studies. For that reason the present study focused on the characterization of Tip in complex with LynSH3 and on the design of a single point mutant (P17G) Lck which exhibits an increased affinity for Tip. The structural information deduced from these systems should serve as basis to generate a reliable model of the LckSH3-Tip complex. Further analysis revealed that the increased ligand affinity of LynSH3 and LckSH3_P17G is achieved by different mechanisms. For LckSH3_P17G, the increased affinity by almost one order of magnitude compared to wildtype LckSH3 can at least partially be attributed to an increased rate of complex formation as evidenced by fluorescence titration and stopped-flow experiments. A detailed structural explanation for these differences comes from molecular dynamics simulations of wildtype and mutant LckSH3 which revealed that the increased association rate of the mutant correlates with a higher population of binding-competent conformations over the simulation time. LckSH3_P17G exhibits not only a faster local conformational sampling by enhanced RT-loop flexibility, but also an increased overall flexibility on different timescales throughout the entire domain. Moreover, thermal unfolding monitored by CD-spectroscopy and high-temperature MD simulations revealed a global destabilization and an altered unfolding pathway of the LckSH3 P17G-mutant. For the LynSH3-Tip complex a high resolution structure was determined using NMR spectroscopy. Analysis of the complex structure revealed that not only the polyproline helix, which is typically known to form the site of interaction with SH3 domains, but also the COOH-terminally adjacent residues are involved in SH3 binding. Particularly L186 of Tip binds into a hydrophobic pocket on the surface of LynSH3, formed by H41, W44 and F57. Based on the LynSH3-Tip complex structure and additional NMR-spectroscopic data available for the Tip-LckSH3 interaction, a molecular model of the LckSH3-Tip complex was generated. Although experimental data clearly proves that L186 interacts with a hydrophobic pocket on the SH3 surface in both complexes, fluorescence titration experiments using shorter Tip-peptides showed that the interactions of L186 only have a significant effect on the affinity in the LynSH3-Tip complex. Further analysis indicated that L186 of Tip bound to the hydrophobic pocket of LynSH3 is almost completely covered by H41, whereas the serine at homolog position in LckSH3 covers only small parts of L186. Thus, the additional hydrophobic interactions between H41 of LynSH3 and L186 of Tip outside the classical ligand-binding motif offer a plausible explanation for the tighter Tip-binding of LynSH3 compared to LckSH3, thus resulting in a reduction of the dissociation rate, which is in good agreement with the different exchange behavior on the NMR timescale. Taken together, apart from elucidating the molecular basis of the interactions of LckSH3 with the herpesviral Tip protein, this study was able to show that affinity can be altered by entirely different mechanisms even for closely related proteins. Therefore, this study stresses the importance of a concomitant characterization of the structure and dynamics of macromolecular interactions to understand the mechanisms of molecular recognition in more detail and thus to allow more reliable predictions in the future.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Finn Bauer
Advisor:Prof. Dr. Heinrich Sticht
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:16.06.2005
Year of Completion:2005
SWD-Keyword:Bindungsenergie; Ligand <Biochemie>; Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie; Molekulardynamik
Tag:Ligandenaffinität; flankierende Bereiche; konformationelles Abtasten
conformational sampling; flanking regions; ligand affinity
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-1600
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):13.07.2005