Strukturbiologische Untersuchungen und Faltungsstudien von Modellproteinen mittels NMR-Spektroskopie

Structure determination and folding studies of model proteins by NMR spectroscopy

Die biologische Funktion von Proteinen basiert in den meisten Fällen auf einer definierten dreidimensionalen Struktur, die sich im Verlauf der Proteinfaltung ausbildet. In dieser Arbeit wurden die Modellproteine CspB aus B. subtilis, RNase T1 aus A. oryzae, ORF56 aus S. islandicus sowie des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d mit einer Reihe biophysikalischer Methoden ausführlich charakterisiert. Die schnelle interne Dynamik von CspB wurde bei verschiedenen Lösungsmittelviskositäten untersucht, wobeDie biologische Funktion von Proteinen basiert in den meisten Fällen auf einer definierten dreidimensionalen Struktur, die sich im Verlauf der Proteinfaltung ausbildet. In dieser Arbeit wurden die Modellproteine CspB aus B. subtilis, RNase T1 aus A. oryzae, ORF56 aus S. islandicus sowie des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d mit einer Reihe biophysikalischer Methoden ausführlich charakterisiert. Die schnelle interne Dynamik von CspB wurde bei verschiedenen Lösungsmittelviskositäten untersucht, wobei durch eine erweiterte Lipari-Szabo-Analyse der 15N-Relaxationsparameter die Rotationskorrelationszeit iterativ optimiert. Diese stellt einen empfindlichen Sensor gegenüber der unmittelbaren Umgebung des Proteins innerhalb der Hydratationshülle dar, wobei die Geschwindigkeit der Gesamtbewegung nicht von der Größe des Proteins inklusive seiner Hydratationshülle sondern vielmehr von deren Mikroviskosität abhängt. Die Dynamik im ps- bis ns-Bereich bleibt bei steigender Viskosität nahezu unverändert. Der Beitrag des chemischen Austauschs (Rex) zur transversalen Relaxationsrate ist über das gesamte Protein verteilt und korreliert nicht mit Sekundärstrukturelementen oder flexiblen Schleifen. Rex repräsentiert daher nicht die lokale Dynamik einzelner Reste sondern ist auf die globale Faltungsreaktion von CspB im Millisekundenbereich zurückzuführen. Durch die Erhöhung der Viskosität wird die Größe und Anzahl der Rex-Beiträge signifikant reduziert. Die Kooperativität der Millisekundenfaltung von CspB wurde anhand dynamischer NMR-Methoden untersucht, wobei die Bestimmung der Faltungsraten mit R2-Dispersionsmessungen die verlässlichsten Ergebnisse lieferte. Die 24 analysierten ortsspezifischen Sonden zeigen sehr ähnliche apparente Faltungsraten und stimmen gut mit stopped flow Fluoreszenz detektierten Faltungsraten überein. Die Faltung verläuft kooperativ und über einen wenig heterogenen Übergangszustand. Die Wechselwirkung von CspB mit einzelsträngiger DNA wurde auf struktureller Ebene charakterisiert. Die aus Sequenzvergleichen postulierte potentielle Bindungsregion von CspB wurde mittels NMR-Titrationsexperimenten verifiziert. Dabei konnten zusätzliche Aminosäuren außerhalb der Bindungsmotive identifiziert werden, die für die Interaktion sehr wichtig sind. Die Beiträge einzelner Reste zur Bindungsaffinität wurden anhand einer Mutationsanalyse bestimmt, wobei die Lösungsmittel-exponierten Phenylalanine essentiell für eine feste Bindung sind. Aus der Strukturbestimmung von CspB im Komplex mit dem ssDNA-Fragment dT7 folgte, dass das Proteinrückgrat nahezu unverändert vorliegt und die Hauptunterschiede in der relativen Orientierung der aromatischen Seitenketten liegen. Die Modellierung der Struktur des Komplexes mit HADDOCK weist auf die vermuteten Stapel-Wechselwirkungen der aromatischen Seitenketten mit den Basen der ssDNA hin. Die Bindung der Nukleinsäure stabilisiert CspB. Das homodimere Protein ORF56 aus dem acidohyperthermophilen Archaeon Sulfolobus islandicus wurde mit einer Fülle von biophysikalischen Methoden studiert und dessen dreidimensionale Struktur mittels NMR bestimmt. Diese ähnelt der des Arc-Repressor sehr. Die Faltung von ORF56 kann sowohl im Gleichgewicht als auch in der Faltungskinetik mit dem Zweizustandsmodell für dimere Proteine beschrieben werden. Das Protein besitzt eine außerordentlich hohe Stabilität, was in dem extrapolierten Schmelzpunkt der thermischen Entfaltung von 107 °C zum Ausdruck kommt. Diese extreme Stabilität wird von der schnellen simultanen Assoziations-/Faltungsreaktion aber vor allem durch die besonders langsame Entfaltungsreaktion (5.7 pro Jahr) bestimmt. Die Entwicklung höherdimensionaler Echtzeit NMR-Techniken zum Studium langsamer Faltungsreaktionen wurde mit S54G/P55N RNase T1 durchgeführt. Die geschwindigkeitsbestimmende trans/cis Isomerisierung der Y38-P39 Peptidbindung synchronisiert die kooperative Rückfaltung des Faltungsintermediats, was anhand einer Vielzahl von ortsspezifischen Sonden gezeigt wurde. Die Aufnahme von 3D Echtzeit NOESY-HSQC-Spektren ermöglichte die Zuordnung des Proteinrückgrats des Faltungsintermediats und die Identifizierung von NOE-Kreuzsignalen, die die Basis für eine zukünftige Strukturbestimmung des transienten Zustands bilden. Die Faltung des humanen CDK-Inhibitors p19INK4d, der weder Trp noch Tyr enthält, wurde mit Circulardichroismus und Phenylalanin-Fluoreszenz beobachtet. Mittels dieser optischen Sonden wurde im Gleichgewicht ein apparentes Zweizustandsmodell gefunden. Allerdings wurde in einem NMR-detektierten Entfaltungsübergang ein dritter Zustand bei mittleren Harnstoffkonzentrationen detektiert. Unter stark nativen Bedingungen konnten drei Rückfaltungsphasen aufgelöst werden. Die langsamste Phase kann mit PPIasen signifikant beschleunigt werden, was auf eine Prolyl-cis/trans-Isomerisierung hindeutet, die mittels 1D Echtzeit NMR-Spektroskopie verfolgt werden konnte.show moreshow less
The biological function of proteins is in most cases defined by their three dimensional structure, which is formed by the protein folding reaction. In this thesis the model proteins CspB from B. subtilis, RNase T1 from A. oryzae, ORF56 from S. islandicus, and human CDK inhibitor p19INK4d were studied with various biophysical techniques in great detail. Fast internal dynamics of CspB were investigated at different solvent viscosities by an extended Lipari-Szabo model free analysis of 15N relaxatiThe biological function of proteins is in most cases defined by their three dimensional structure, which is formed by the protein folding reaction. In this thesis the model proteins CspB from B. subtilis, RNase T1 from A. oryzae, ORF56 from S. islandicus, and human CDK inhibitor p19INK4d were studied with various biophysical techniques in great detail. Fast internal dynamics of CspB were investigated at different solvent viscosities by an extended Lipari-Szabo model free analysis of 15N relaxation data. The overall rotational correlation time, which is a sensitive probe on the local environment and the solvent composition of its hydration shell was iteratively optimized. The microscopic viscosity rather than the extent of the protein and its hydration shell determines the overall tumbling of the protein. Dynamics on the ps to ns timescale are mainly independent of the solvent viscosity, whereas chemical exchange contributions (Rex) to the transversal relaxation rate are equally distributed over the entire protein and are not correlated with secondary structure elements or loop regions. Therefore, Rex cannot be interpreted as usual as local mobility because the exchange originates from the fast folding reactions on a millisecond timescale. The increase in viscosity leads to a significant reduction of the extent and number of Rex contributions. The cooperativity of the folding reaction of CspB was probed by various dynamic NMR techniques, whereas the determination of folding rates using R2 relaxation dispersion measurements gave the most reliable results. All 24 analyzed site specific probes depict equivalent apparent folding rates, which coincide well with fluorescence detected folding rates. Therefore, the folding reaction is cooperative and the transition state of folding is most likely homogeneous. The interaction of CspB with single stranded DNA (ssDNA) was characterized on a structural basis. The potential binding epitope with the two highly conserved binding motifs RNP1 and RNP2 was postulated from multiple sequence alignments. NMR titration experiments identified additionally important residues for the interaction. To elucidate the individual contributions of residues to the binding affinity CspB variants containing single amino acid substitutions were generated. The contributions of the solvent-exposed phenylalanines are essential for tight binding. Structure determination of CspB in complex with the ssDNA fragment dT7 showed a nearly unchanged backbone structure. The main difference between the structure of free and complexed CspB is the relative orientations of the aromatic side chains. Modelling the CspB/dT7 complex structure with HADDOCK supports the idea of stacking interactions between aromatic amino acid side chains and the bases. The binding of dT7 stabilizes CspB and therefore alters the fast internal motions. The homodimeric ORF56 protein from the acidohalophilic and hyperthermophilic Archaeon Sulfolobus islandicus was studied in great detail by many biophysical methods. Also the three dimensional structure was determined by NMR, which resembles the structure of homologuous P22 Arc repressor. ORF56 folding can be described by the two state model of dimeric proteins in equilibrium as well as in folding kinetics. The protein displays a remarkable thermodynamic stability represented by the extrapolated melting temperature of 107 °C. This outstanding stability is determined by the fast and simultaneous folding and association of ORF56 and the extremely slow unfolding reaction (5.7 per year). The development of two and three dimensional real-time NMR techniques to study slow protein folding reactions was applied to S54G/P55N RNase T1. The rate determining cis/trans isomerization of peptide bond Y38-P39 synchonizes the cooperative refolding reaction of the folding intermediate, which was found by analyzing many site specific probes. With the acquisition of real-time 3D NOESY-HSQC spectra during the refolding reaction the sequence specific assignment of the resonances of the folding intermediate was performed. The identification of NOE cross peaks of the transient intermediate are the basis for a future structure determination of this state. The folding of human CDK inhibitor p19INK4d, which contains no Trp or Tyr residues was characterized by circular dichroism and the intrinsic phenylalanine fluorescence. The optical probes monitor an apparent two state unfolding transitions whereas in a urea induced unfolding transition detected by NMR revealed an additional third species at intermediate urea concentrations. Refolding kinetics under strong native conditions revealed three phases. The slowest phase can be significantly accelerated by PPIases indicating that this phase is caused by a prolyl cis/trans isomerization, which was also investigated by 1D real-time NMR spectroscopy.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Markus Wolfgang Zeeb
Advisor:PD, Dr. Jochen Balbach
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:07.05.2004
Year of Completion:2004
SWD-Keyword:Dynamik; NMR-Spektroskopie; Proteinfaltung
Tag:DNA-Bindung; Kälteschock; Tumor-Suppressor
DNA binding; NMR spectroscopy; cold shock; dynamics; protein folding
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-889
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):18.05.2004