Entwicklung transgenbasierter Systeme zur Anwendung im Rahmen der Sterilen Insekten Technik, einer ökologisch verträglichen Schädlingsbekämpfungsmethode

Development of transgene-based systems for the application on Sterile Insect Technique, an ecologically safe method for area-wide control

Biologische Strategien zur Bekämpfung ökonomisch relevanter Schadinsekten bieten sich als Alternative zur insektizidbasierten Kontrolle an. Die Sterile Insekten Technik (SIT) ist eine ökologisch verträgliche Methode zur flächendeckenden Populationskontrolle. Sie beruht auf dem Prinzip der Reduktion einer Schädlingspopulation durch wiederholte Massenfreisetzungen steriler Artgenossen. Für viele Schadinsekten ist SIT am wirksamsten, wenn ausschließlich sterile Männchen freigesetzt werden. Zur SterBiologische Strategien zur Bekämpfung ökonomisch relevanter Schadinsekten bieten sich als Alternative zur insektizidbasierten Kontrolle an. Die Sterile Insekten Technik (SIT) ist eine ökologisch verträgliche Methode zur flächendeckenden Populationskontrolle. Sie beruht auf dem Prinzip der Reduktion einer Schädlingspopulation durch wiederholte Massenfreisetzungen steriler Artgenossen. Für viele Schadinsekten ist SIT am wirksamsten, wenn ausschließlich sterile Männchen freigesetzt werden. Zur Sterilisierung wird konventionell ionisierende Strahlung eingesetzt, welche die Fitness behandelter Insekten und damit die Wirksamkeit der SIT vermindert. Diese Arbeit dokumentiert die Etablierung eines Sterilisierungssystems, das Transgene anstelle ionisierender Strahlung verwendet. Das neuartige Sterilitätskonzept beruht auf supprimier-barer Induktion embryospezifischer Letalität. Um dieses Konzept im Modellinsekt Drosophila melanogaster zu realisieren, wurden 5’ genregulatorische Regionen der Zellularisierungsgene serendipity alpha (sry alpha) und nullo ausgewählt, die ausschließlich in einem engen Zeitfenster während der frühen Embryonalentwicklung aktiv sind. Diese Regulatorsequenzen steuern die Genexpression des tetracyclinkontrollierten Transaktivators tTA. Zur Erzeugung von Letalität stimuliert tTA die Expression eines hyperaktiven Allels des proapoptotischen Gens head involution defective (hid). Da die DNA-Bindung des tTA-Proteins durch Tetracyclin (Tc) inhibiert wird, kann tTA als Schalter zwischen restriktiven und permissiven Bedingungen fungieren: In Drosophila-Embryonen, die eine einfache Kopie der Transgenkombination erbten, manifestierte sich unter restriktiven Bedingungen (ohne Tc) die Letalität mit einer Penetranz von 99,9%. Unter permissiven Bedingungen hingegen (mit Tc) konnte embryonale Letalität supprimiert werden, was die kontinuierliche Produktion großer Mengen steriler Insekten ermöglicht. Mit sterilen Männchen wurden SIT-Situationen im kleinen Labormaßstab simuliert. Dabei zeigte sich, daß sterile Männchen wirksam mit fertilen Männchen um Weibchen konkurrierten und die Nachkommenzahl reduzierten. Um homologieunabhängig embryo- oder geschlechtsspezifisch aktive Enhancer in Schadinsekten identifizieren zu können, wurde in dieser Arbeit außerdem ein System zum Aufspüren von Enhanceraktivitäten etabliert. Dieses System beruht auf der kontrollierten Mobilisierung von „Mutatoren“, die auf dem Transposon piggyBac basieren und deren Reporterfunktion erfolgreich zum Nachweis von Enhanceraktivitäten eingesetzt werden konnte. Diese piggyBac-Mutatoren erwiesen sich in Drosophila melanogaster als effizient mobilisierbar und erzeugten homozygot letale Mutationen mit einer Frequenz von 7,6%. Das System besitzt somit Anwendungspotential zur funktionellen Insekten-Genomanalyse. Beide Systeme sind in ein Keimbahntransformationssystem eingebettet, das auf speziesunabhängig funktionierenden Breitband-Transposons und separierbaren Transformations-markern basiert. Diese Systeme sollten daher direkt auf Schadinsekten übertragen und auf ihre Funktionalität überprüft werden können.show moreshow less
Biological approaches to insect pest management offer alternatives to insecticidal control. The Sterile Insect Technique (SIT) is regarded as an ecologically safe method for area-wide control. SIT reduces the pest population by mass release of sterilized pest organisms. For many pest species, SIT proved to be most effective if only sterile males were released. However, conventional sterilization by ionizing radiation lowers insect fitness and therefore impairs effectiveness of the SIT. In this tBiological approaches to insect pest management offer alternatives to insecticidal control. The Sterile Insect Technique (SIT) is regarded as an ecologically safe method for area-wide control. SIT reduces the pest population by mass release of sterilized pest organisms. For many pest species, SIT proved to be most effective if only sterile males were released. However, conventional sterilization by ionizing radiation lowers insect fitness and therefore impairs effectiveness of the SIT. In this thesis a transgene-based approach to cause sterility without the need of irradiation is reported. A novel concept of sterility was developed that employs suppressible dominant embryo-specific lethality. In order to investigate this principle, the model insect, Drosophila melanogaster, was chosen: 5’ regulatory sequences of the cellularization genes serendipity alpha (sry alpha) and nullo were selected, which mediate gene expression exclusively during early embryogenesis. The tetracycline-controlled transactivator gene tTA was placed under control of these cellularization gene enhancer-promoters. To mediate lethality, a hyperactive allele of the pro-apoptotic gene head involution defective (hid) was placed under control of the transactivator tTA. Due to the inhibition of the tTA-DNA binding by tetracycline (Tc), the tTA protein functions as a switch to discriminate restrictive from permissive conditions: Under restrictive conditions (without Tc) lethality manifested with a penetrance of 99.9% in Drosophila embryos, which inherited one copy of the transgene combination. Under permissive conditions (with Tc) lethality could be suppressed, which allows for continual generation of large quantities of sterile insects. Sterile males were examined in small laboratory scale SIT simulations. In these situations, sterile males effectively competed with fertile males for females and lowered numbers of progeny. Taken together, these data provide a proof-of-principle of the transgene-based sterility concept. In order to identify embryo-specifically active enhancer in pest insects independently of homology-based cloning strategies, a system to trap enhancer activity was established. This system relies on the controlled mobilization of “mutators”, which were constructed using the transposable element piggyBac. Mutators were designed to include reporter functions and were successfully employed to detect enhancer activities. piggyBac mutators were shown to be efficiently mobilizable in Drosophila melanogaster and produced homozygous lethal mutations with a frequency of 7.6%. Therefore, the piggyBac insertional mutagenesis system holds application potential for the aim of functional insect genomics. Both systems have been integrated into a germline transformation system, which relies on species-independent broad host-range transposable elements and species-independent transformation markers that can be discriminated phenotypically. This provides the means to transfer and functionally analyze both the sterility and the insertional mutagenesis systems in a large variety of pest insects.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Biologie
Author: Carsten Horn
Advisor:Prof. Dr. Christian Lehner
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:23.10.2003
Year of Completion:2003
SWD-Keyword:Autozidverfahren; Transposon-tagging
Tag:Insekten Transgenese; Keimbahntransformation; Sterile Insekten Technik; Transposon Mutagenese; piggyBac
Insect transgenesis; Sterile Insect Technique; germ-line transformation; piggyBac; transposon mutagenesis
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
RVK - Regensburg Classification:WG 1700
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-600
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):23.10.2003