Untersuchungen zur Funktion der Protein-Tyrosin-Phosphatase PTPRR

Examination of the role of the protein tyrosine phosphatase PTPRR

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Funktion der PTPRR in der zellulären Signaltransduktion mit den Schwerpunkten Substrate, Regulation und Beteiligung an biologischen Prozessen. Von besonderem Interesse war die Rolle der PTPRR bei der Tumorentstehung und Transformation von Zellen. Dabei wurden noch unveröffentlichte Daten bestätigt, daß PTPRR die MAPKn ERK1 und 2 über ein neuartiges MAPK-Bindungsmotiv, das KIM, sowohl in vitro als auch in vivo binden und dephosphorylieren kann. Somit isZiel dieser Arbeit war die Untersuchung der Funktion der PTPRR in der zellulären Signaltransduktion mit den Schwerpunkten Substrate, Regulation und Beteiligung an biologischen Prozessen. Von besonderem Interesse war die Rolle der PTPRR bei der Tumorentstehung und Transformation von Zellen. Dabei wurden noch unveröffentlichte Daten bestätigt, daß PTPRR die MAPKn ERK1 und 2 über ein neuartiges MAPK-Bindungsmotiv, das KIM, sowohl in vitro als auch in vivo binden und dephosphorylieren kann. Somit ist PTPRR die erste tyrosinspezifische Phosphatase, der eine Dephosphorylierung von MAPKn in höheren Eukaryonten nachgewiesen wurde. Eine weitere Analyse durch transiente Überexpression der PTPRR in HEK293-Zellen ergab, daß PTPRR spezifisch die MAPKn ERK1/2, nicht jedoch p38 Kinase oder JNK/SAPK dephosphoryliert. Zudem wurde über Transkriptionsaktivierungs-experimente der Nachweis erbracht, daß PTPRR die ERK1/2-vermittelte Aktivierung von Transkriptionsfaktoren negativ beeinflussen kann. Bei der näheren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK1/2 wurde eine vorher unbekannte Verknüpfung des PKA mit dem ERK-Signalweg aufgedeckt. Es wurde gezeigt, daß PKA den im KIM gelegenen Serinrest in der Position 321 der Aminosäuresequenz der PTPRR phosphorylieren und so die Bindung und Dephosphorylierung der ERK1/2 in vivo inhibieren kann. Dies weist auf einen neuartigen Mechanismus hin, über den PKA die Aktivierung des MAPK-Signalwegs reguliert. Ein weiterer Effekt, der nachgewiesen wurde, ist die Inhibition der c-Src-induzierten Phosphorylierung des KIF1C, welcher am retrograden Transport vom Golgi-Apparat zum Endoplasmatischen Retikulium beteiligt ist. Damit wurde PTPRR als erste PTPase mit einer Dephosphorylierung des KIF1C in Verbindung gebracht. Über in vitro-Assoziation mit GST-PTPRR im präparativen Maßstab mit anschließender Sequenzierung der gebundenen Proteine wurden die Hitzeschockproteine HSP70 und GRP78 als in vitro Bindungspartner der PTPRR identifiziert. Die nähere Untersuchung der Bindung ergab, daß diese innerhalb der Juxtamenbrandomäne der PTPRR erfolgt und von ATP abhängig ist. Diese Art der Bindung ist ein Anzeichen dafür, daß die Wechselwirkung spezifisch und PTPRR ein Substrat der Chaperone HSP70 und GRP78 ist, welche für die korrekte Faltung von Proteinen sorgen. Da HSP70 ebenfalls mit anderen Mitgliedern des ERK-Signalwegs wechselwirken kann und zudem aus Komplexen mit den MAPK-Kaskade-Gerüstproteinen KSR und HSP90 isoliert wurde, ergibt sich aus der Assoziation von PTPRR und HSP70 die Möglichkeit einer Beteiligung an einem Multiprotein-ERK-Signalkomplex. Bei der Analyse der endogenen Proteinexpression der PTPRR wurde erstmals das Auftreten verschiedener Isoformen in humanen Zellen nachgewiesen. Über Immunfluoreszenz wurde gezeigt, daß die zytoplasmatische Isoform PTPRRcyto im gesamten Zytoplasma vorkommt, während die Isoform PTPRR TM in perinukleären Vesikeln lokalisiert ist. Ein Vergleich der Effekte verschiedener überexprimierter Isoformen zeigte Unterschiede sowohl bei der PDGF-induzierten Phosphorylierung der ERK1/2 als auch bei der c-Src-vermittelten Phosphorylierung des KIF1C. Zudem wurden in Transkriptionsaktivierungsexperimenten Unterschiede in der ERK1/2-vermittelten Aktivierung von Transkriptionsfaktoren detektiert. In allen Fällen hatte die zytoplasmatische Isoform die stärkste inhibitorische Wirkung. Ferner wurde in stabil mit PTPRR transfizierten NIH3T3-Zellen der Effekt dieser PTPase auf biologische Prozesse untersucht. Dabei wurde ein negativer Einfluß der Überexpression der PTPRR auf die basale und PDGF-induzierte Proliferation sowie auf die Migration der Zellen beobachtet, welche beide an der Tumorentstehung beteiligt sein können. Die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen PTPRR und ERK für diese Effekte wurde dadurch belegt, daß eine Mutante der PTPRR, die ERK1/2 nicht mehr bindet, in beiden Experimenten keine Wirkung zeigte. Außerdem konnte die Überexpression der PTPRR sowie der verwandten PTPase STEP die durch die Onkogene v-Ki-Ras- und Her2-, nicht jedoch die durch v-ErbB- oder v-Fms-induzierte Transformation von NIH3T3-Zellen in Focusbildungs-experimenten verhindern. Zudem reduzierte die Überexpression der PTPRR die Her2-vermittelte Proliferation von Zellen unter Entzug von Wachstumsfaktoren. Diese Daten liefern nicht nur Hinweise auf eine potentiell tumorsupprimierende Wirkung der PTPRR und STEP, sondern gewähren auch Einblicke in die von den Onkogenen ausgehenden Signalwege, die zur Transformation von Zellen führen. Auch wurde nachgewiesen, daß der Expressionslevel der PTPRR in Tumorzellinien und –geweben im Vergleich zu nichttransformierten Zellinien und Geweben erhöht ist. Es ergeben sich erste Hinweise auf einen Rückkopplungsmechanismus, mit dem Zellen versuchen könnten, die durch Onkogene häufig hyperaktivierten ERKn negativ zu regulieren.show moreshow less
Issue of this work was the examination of the protein-tyrosine phosphatase PTPRR in the context of cellular signal transduction with emphasis on substrates, regulation and involvement in biological processes. Of special interest was the role of PTPRR in the transformation of cells and tumour development. This work revealed that PTPRR is able to bind the MAPKinases (mitogen activated protein kinases) ERK1 and 2 (extracellular regulated kinases 1 and 2) via a previously unknown MAPK binding motiv,Issue of this work was the examination of the protein-tyrosine phosphatase PTPRR in the context of cellular signal transduction with emphasis on substrates, regulation and involvement in biological processes. Of special interest was the role of PTPRR in the transformation of cells and tumour development. This work revealed that PTPRR is able to bind the MAPKinases (mitogen activated protein kinases) ERK1 and 2 (extracellular regulated kinases 1 and 2) via a previously unknown MAPK binding motiv, the KIM (kinase interaction motif) both in vivo and in vitro, and dephosphorylate them. This was in proof of data that had not been published at the beginning of this study. PTPRR is the first tyrosine-specific phosphatase that has been shown to dephosphorylate MAPKinases in higher Eucaryotes. The following analysis through overexpression in HEK293 cells demonstrated that PTPRR deposphorylates specifically the MAPKinases ERK 1 and 2, but not p38 Kinase or JNK/SAPK. Furthermore, reportergene assays indicated that PTPRR can negatively regulate the activation of transcription factors by ERK1/2. A closer examination of the interaction between ERK and PTPRR discovered a previously unknown link between the PKA(cAMP dependent protein kinase) and ERK signalling pathways. It was shown that PKA can phosphorylate PTPRR at a serine residue at position 321 and thereby regulate the binding to and dephosphorylation of ERK1/2 in vivo. This indicates a novel mechanism by which PKA can regulate the activation of the MAPK signalling pathway. Another effect of PTPRR revealed in this work is the inibition of the c-src induced phosphorylation of KIF1C(Kinesin interacting factor 1C). KIF1C is involved in the retrograde transport from the Golgi to the Endoplasmatic Reticulum. PTPRR is the first PTPase that was shown to be involved in the dephospharylation of KIF1C. Preparative pull-down experiments with GST-PTPRR fusion proteins and subsequent sequencing of bound proteins identified the heat shock proteins HSP70 and GRP78 as in vitro binding partners of PTPRR. This interaction takes place within the juxtamembrane domain of PTPRR and is dependent on ATP. These observations demonstrate that the binding is specific and PTPRR is a substrate of HSP70 and GRP78, which assure structural integrity of PTPRR. As HSP70 can interact with other members of the ERK signalling cascade and was isolated from the ERK cascade scaffold proteins KSR and HSP70, the interaction between PTPRR and HSP70 gives rise to the possibility of an involvement of PTPRR in a multiprotein-ERK signalling complex. The analysis of endogenous protein expression of PTPRR revealed the existence of different isoforms in human cells. In immune fluorescence experiments the isoform PTPRR TM was detected in perinuclear vesicles, whereas the isoform PTPRRcyto was distributed over the entire cytoplasm. A comparison between the effects of different overexpressed isoforms showed differences not only in the PDGF-induced phosphorylation but also in the c-src-dependent phosphorylation of KIF1C. In addition, differences in the ERK1/2 mediated activation of transcription were detected with reportergene assays. In all experiments the cytoplasmatic isoform of PTPRR displayed the strongest inhibition. Furthermore, the effect of PTPRR on biological processes was examined in stably transfected NIH3T3 cells. A negative effect of the overexpression of PTPRR both on basal and PDGF-induced proliferation and on migration of cells was observed. Both processes are involved in tumour formation. The importance of the interaction between PTPRR and ERK for this negative regulation was verified with a mutant of PTPRR deficient in ERK binding, which did not show any effects in both experiments. In focus formation experiments, the overexpression of PTPRR or the closely related PTPase STEP inhibited the transformation of NIH3T3 cells caused by the oncogenes v-Ki-Ras and Her2, but not by v-ErbB or v-Fms. In addition, PTPRR inhibited the Her2-mediated proliferation of cells under conditions of serum starvation. These results do not only point to a possible tumoursuppressive effect of PTPRR, but give also insight into the oncogenic signalling pathways which lead to transformation of cells. The analysis of expression levels of PTPRR in different cell lines and tissues revealed an enhanced level of expression in transformed cells. These data provide first hints for a feedback mechanism by which cells could try to downregulate ERKs hyperactivated by oncogenes.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Jan Eickhoff
Advisor:Prof. Dr. Axel Ullrich
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:30.01.2003
Year of Completion:2003
SWD-Keyword:PC12 Proteintyrosinphosphatase 1; Protein-Tyrosin-Kinasen
Tag:ERK; PKA; Protein-Tyrosin-Phosphatasen
ERK; PKA; PTP-SL; oncogene; protein tyrosine phosphatase
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
RVK - Regensburg Classification:WB 1412
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-529
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):28.08.2003