Transformation einer argentinischen Sommerweizenvarietät (Triticum aestivum L.) durch Transfer eines Seneszenz-verzögernden Gens zur Verbesserung der Ertragsleistung

Transformation of an argentine wheat (Triticum aextivum L.) variety by the transfer of a delaying senescence gene for yield improvement

Um den Seneszenz-Prozess der Weizenpflanze zu verzögern und so eine höhere Ertragsleistung zu erreichen, wurde eine bisher noch nicht übertragene Nutzgenkassette in eine argentinische Weizenvarietät (Triticum aestivum L.) eingebracht. Diese Nutzgenkassette besteht aus der proteincodierenden Region des Isopentenyltransferase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens und dem Seneszenz-spezifischen HvS40-Promotor aus Hordeum vulgare. SCREENING VON WEIZEN-VARIETÄTEN Die Kombination der Embryo-EntwicklungUm den Seneszenz-Prozess der Weizenpflanze zu verzögern und so eine höhere Ertragsleistung zu erreichen, wurde eine bisher noch nicht übertragene Nutzgenkassette in eine argentinische Weizenvarietät (Triticum aestivum L.) eingebracht. Diese Nutzgenkassette besteht aus der proteincodierenden Region des Isopentenyltransferase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens und dem Seneszenz-spezifischen HvS40-Promotor aus Hordeum vulgare. SCREENING VON WEIZEN-VARIETÄTEN Die Kombination der Embryo-Entwicklungsstadien H und W mit den zwei 2,4-D Konzentrationen ergab vier verschiedene Bedingungen, denen alle 22 argentinischen Sommerweizenvarietäten ausgesetzt wurden. Insgesamt wurden 10091 unreife Embryonen getestet. Die besten Ergebnisse bei fünf von sechs der getesteten Parameter erbrachte die Kombination des Entwicklungsstadiums H und der Auxinkonzentration 1 mg 2,4-D /l medium. Die Induktion eines Scutellarkallus sowie die Regenerationsfähigkeit der unreifen Embryonen zur Pflanze waren vom Genotyp, vom Entwicklungsstadium und von der 2,4-D Konzentration im Medium abhängig. TRANSFORMATION UND IN VITRO GEWEBEKULTUR DER EMBRYONEN DES WEIZENS Für Klein Brujo konnte ein auf Partikelbeschusstechnik basierendes Transformationssystem etabliert werden. Nach der Optimierung der Beschussbedingungen ergaben sich drei Variable, die für eine hohe Transformationseffizienz von Klein Brujo (10 % im besten Versuch) entscheidend waren: das Kallus-Induktionsmedium, die Vorkultur und das osmotische Behandlungsmedium. Die neu etablierte Gewebekulturstrategie führte zu einer Verkürzung der in vitro Kulturdauer zwischen Embryonenpräparation und ex vitro Kultur. Die Verwendung von Phosphinothricin (PPT) als Selektionsmittel während der ex vitro Kultur minimierte die Anzahl falscher Positiver unter den überlebenden Pflanzen (Cotransformanten 97,4%). Allerdings ließen sich durch unabhängige Segregation keine Reporter- bzw. Selektionsgen-freien T1-Pflanzen kultivieren. In allen T0-Regeneraten konnte über Southern blot-Analysen die proteincodierende Region des eingeführten ipt-Gens nachgewiesen werden (Genkopien zwischen 2 und 7). Das Konstrukt aus einem um 2 kb verkürzten HvS40-Promotor (welcher in dieser Arbeit neu konstruiert wurde) und dem ipt-Gen (pS40-IPT) wurde in Weizenblättern sowohl bei künstlich induzierter als auch bei natürlicher Seneszenz exprimiert. Dies wurde mittels RT-PCR der ipt-mRNA in T0- und T2-Pflanzen nachgewiesen. PHYSIOLOGISCHE EFFEKTE DER ÜBERTRAGUNG DES IPT-GENS UND DER ERTRAGSLEISTUNG Um einen Hinweis auf die Funktion des ipt-Gens zu bekommen wurde der Chlorophyll-Gehalt während der induzierten Seneszenz von voll entwickelten, abgeschnittenen Fahnenblättern von transgenen T1-Pflanzen gemessen. Bei fünf von den sechs untersuchenden Transgenen zeigte sich ein deutlich geringerer Chlorophyll-Verlust was auf die Aktivität des ipt-Gens und eine erhöhte Cytokininkonzentration hindeutet. Das Chl a/b-Verhältnis war höher als bei den Kontrollen, da das Chl a während der Seneszenz-Verzögerung langsamer als das Chl b abgebaut wird. Der Gehalt der dominierenden Cytokinine und der O-Glucoside, wurde in seneszierenden Fahnenblättern von T1- und T2-Pfanzen der drei pS40-IPT Linien analysiert. Eine beinahe Verdopplung des Cytokinin-Gesamtgehaltes gegenüber der Azygoten konnte in Extrakten der seneszierenden Fahnenblätter nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der RT-PCR Analyse der transgenen Pflanzen zeigten eine höhere Expression des ipt-Gens während der Kornfüllungsphase verglichen mit der Anthese. Allerdings war der Cytokiningehalt in intakten Pflanzen trotz des Promoters aus Gerste nicht ausreichend, um eine deutliche Seneszenz-Verzögerung hervorzurufen. Dieser Effekt von ipt-Expression kann durch den schwachen Promotor oder durch eine partielle Fremdgenstilllegung des übertragenen Gens zustande gekommen sein. Die homozygoten T2-Pflanzen der vier Klein Brujo-Linien wurden mit den entsprechenden azygoten Pflanzen verglichen. Bei der Sorte „Klein Brujo“ wurde in allen vier transgenen Linien keine deutlich sichtbare Seneszenz-Verzögerung sowohl während der sequenziellen Seneszenz der Blattorgane als auch während der monokarpischen Seneszenz der ganzen Pflanze festgestellt. Allerdings zeigten zwei Linien gegenüber den Azygoten bei den Parametern Körner pro Ähre, Korngewicht insgesamt sowie durchschnittliches Korngewicht höhere Ergebnisse. Die Steigerung der Kornanzahl wurde durch ein niedrigeres Korngewicht nicht aufgewogen. Es ist heutzutage allgemein akzeptiert, dass die Photosynthese der Ähre einen wichtigen Beitrag zum Kornertrag liefert. Die höhere Blattanzahl sowie die längere Lebenszeit der Fahnenblätter und Ähren der zwei homozygoten Linien könnte die bessere Versorgung ihrer Körner erklären. Neben einer Bestätigung der Expression des ipt-Gens könnte sowohl die Steigerung des Cytokinin-Gehalts in der Weizenähre als auch in Endosperm-Zellen des Weizenkorns eine weitere Erklärung für die bessere Ertragsleistung der zwei transgenen Linien sein. Denn es wurde gezeigt, dass Cytokinin die Kornanzahl steigert und die Kornentwicklung stimuliert, wenn es auf die Ähre oder auf die oberirdischen Teile der Weizenpflanze aufgetragen wird. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit sollte versucht werden, eine Seneszenzverzögerung in den Blättern durch den Transfer des ipt-Gens unter Kontrolle des homologen Seneszenz-assoziierten Promotors zu erreichen, der aber nicht in Fahnenblatt aktiv ist. Dies könnte sich letztlich günstig auf das Ährenwachstum auswirken, so dass Ähren mit einer größeren Kornzahl und somit einem höheren Kornertrag entstehen würden. show moreshow less
In an attempt to delay the onset of senescence and to accordingly achieve a higher harvest yield, a hitherto unemployed gene construct was transferred into a summer variety of Argentine wheat. This gene construct consists of the protein-encoding region of the isopentenyl transferase gene from Agrobacterium tumefaciens and the senescence-specific HvS40-promoter from Hordeum vulgare. SCREENING OF SUMMER WHEAT VARIETIES The combination of the developmental stages H and W, which differ in the lenIn an attempt to delay the onset of senescence and to accordingly achieve a higher harvest yield, a hitherto unemployed gene construct was transferred into a summer variety of Argentine wheat. This gene construct consists of the protein-encoding region of the isopentenyl transferase gene from Agrobacterium tumefaciens and the senescence-specific HvS40-promoter from Hordeum vulgare. SCREENING OF SUMMER WHEAT VARIETIES The combination of the developmental stages H and W, which differ in the lengths of the embryo and the scutellum, with two different 2,4-D concentrations resulted in four different culture conditions to which 22 of Argentine summer wheat varieties investigated have been exposed. A total of 10091 immature embryos were tested. The best results for five of the six parameters tested were provided by the combination of developmental stage H and the auxin concentration of 1 mg 2,4-D/L medium. The induction of scutellar callus formation and the regenerative capacity of the immature embryos to grow into plants depended on each of the genotype, stage of development and concentration of 2,4-D in the medium. TRANSFORMATION AND IN VITRO TISSUE CULTURE OF EMBRYOS OF WHEAT A transformation system based on particle bombardment technology was established for Klein Brujo. Three variables were found to be crucial for a high transformation efficiency of Klein Brujo (10% in the best experiment): the callus induction medium, the pre-culture and the osmotic treatment. The newly established tissue culture strategy resulted in a shortening of the in vitro culture duration between embryo preparation and the onset of ex vitro culture. This method of tissue culture - together with the use of phosphinothricin (PPT) as a selection agent during ex vitro culture - minimized the number of so-called “false positives" among the surviving plants. However, it was not possible to cultivate transgenic T1-plants by independent segregation that were free of the marker reporter gene or the selectable marker gene. In all T0-plants the presence of the protein-encoding region of the introduced ipt-gene could be confirmed by Southern blot analysis. The number of the integrated gene copies was between two and seven. The construct of the shortened HvS40-promoter and the ipt-gene (pS40-IPT) was expressed in wheat leaves during the course of both artificially induced and natural senescence. This was detected by means of RT-PCR of ipt-mRNA in T0- and T2-plants. PHYSIOLOGICAL EFFECTS OF THE TRANSFER OF THE IPT-GENE AND YIELD PERFORMANCE The chlorophyll content of young, healthy detached flag leaves of transgenic T1-plants was measured during induced senescence in to obtain an indication of the function of the ipt-gene. Five of the six examined transgenes showed a significantly reduced chlorophyll loss, which suggests activity of the ipt-gene and an increased cytokinin concentration. The Chl a/b ratio was higher than in the controls, since Chl a was degraded more slowly than Chl b during the senescence delay. The content of the dominant cytokinins and the O-glucosides were analyzed in senescing flag leaves of the T1- and T2-plants of the three pS40-IPT lines. A near doubling of the total cytokinin content as compared to the azygous plants could be detected in the extracts of senescing flag leaves. According to the results of the RT-PCR analysis, the transgenes showed a higher expression of the ipt-gene during the grain filling stage than after anthesis. However, the cytokinin content in intact plants was not sufficient to result in a significant delay of senescence in spite of the heterologous expression stemming from the barley promoter expression. This effect of ipt-expression may have been due to the weak promoter or to partial silencing of the transferred gene. The homozygous T2-plants of the four Klein Brujo were compared with the corresponding azygous plants. No clearly visible delay of senescence was detected in any of the four transgenic lines of the variety Klein Brujo during either the sequential senescence of the leaf organs or during the canopy-wide monocarpic senescence triggered by reproductive development. However, two lines showed higher values in the parameters grain number per ear, total grain weight, grain weight per ear and average grain weight in comparison to the azygous plants. The increase in grain number was not compensated for by a lower grain weight. It is now generally accepted that ear photosynthesis makes an important contribution to the final grain yield. The more numerous leaves as well as the greater size of the flag leaves and spikes in the two homozygous lines could explain the better supply to the grains of these plants. In addition to confirming the expression of the ipt-gene, the increase in the cytokinin content of the wheat spikes and the endosperm cells of the wheat grain can provide a further explanation for the improved yield performance of the two transgenic lines. It has been shown that cytokinin increases the grain number and stimulates the development of the grain when it is applied to the ear or to the whole aerial part of wheat plants. Based on the results of this work it should be tried to achieve a delay of senescence of the seedling leaves by transfer of ipt-gene under control of homologous senescence-associated promoter, whose activity doesn´t work in the flag leaf. This finally could have favorable impact on the spike growth, so that ears could produce more grains and thereby raise productivity. show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Biologie
Author: Eduardo Daniel Souza Canada
Advisor:Prof. Dr. Erwin Beck
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:12.06.2012
Year of Completion:2012
SWD-Keyword:Cytokinine; Seneszenz; Weizen
Dewey Decimal Classification:57 Biowissenschaften; Biologie
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus4-8674
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):27.07.2012
Licence (German):License Logokeine Lizenz (Deutsches Urhebergesetz)