Structural insights into RNA binding by NusA and interaction studies of Nun with E. coli Nus factors.

Strukturelle Einblicke in RNA Bindung von NusA und Interaktionsstudie von Nun mit E. coli Nus Faktoren.

In phage lambda, antitermination is initiated by the lambda-encoded N protein which recruits a number of host proteins called Nus factors. Several of these host proteins which are essential for effective transcription termination and antitermination have been identified, these includes NusA, NusB, NusE and NusG. The subject of this work is mainly focused on characterization of interactions between various Nus host factors in the termination and antitermination system by NMR spectroscopy. Like N In phage lambda, antitermination is initiated by the lambda-encoded N protein which recruits a number of host proteins called Nus factors. Several of these host proteins which are essential for effective transcription termination and antitermination have been identified, these includes NusA, NusB, NusE and NusG. The subject of this work is mainly focused on characterization of interactions between various Nus host factors in the termination and antitermination system by NMR spectroscopy. Like N protein, Nun also requires additional host factors for efficient termination. It has been reported already that NusA interacts with C-terminal region of Nun and also that Nun binding to NusA requires NusA ar1 region. On the basis of these results, 1H,15N-HSQC spectra were recorded to monitor the interaction between HK022-Nun and NusA ar1. NMR titration experiments between Nun and NusA clearly showed a lack of chemical shift perturbations. Therefore, it can be concluded that there is no intermolecular interaction between Nun and NusA ar1. Up to date, no information about the interaction between Nun and NusG as well as Nun and NusB are known. Titration experiments between Nun and both Nus factors, have also revealed no direct interaction. Altogether, it can be deduced that there might be no direct interaction between Nun and NusA ar1, and NusG, and NusB. The NusA transcription elongation protein, which binds nut site RNA, contains sequences corresponding to the S1 and KH classes of identified RNA binding domains. To gain comprehensive insights into binding surface on SKK domain upon nut RNA binding, backbone resonances of SKK domain was assigned using sequential C-alpha, C-beta and CO chemical shift information derived from an array of TROSY based triple-resonance experiments. With virtually complete backbone assignment (80.5 %) of the SKK domain it was possible to characterize the interaction between SKK domain and lambda nutL RNA by NMR titration experiments. Significant chemical shift changes observed on SKK domain upon addition of unlabeled lambda nutL RNA, had reflected a direct interaction. Mapping of chemical shift perturbations on SKK domain revealed that the RNA binding interface is mainly located in the KH domains. The results implied a sequence-specific RNA binding. In the free state, NusA cannot bind to RNA. Once alpha-CTD of RNA polymerase is bound to NusA the RNA binding inhibition is released. Direct interactions between alpha-CTD and NusA ar2 have been reported and therefore NusA ar2 could be a prime candidate for inhibiting the RNA binding of NusA. To further evaluate the autoinhibition effect of NusA ar2 on SKK domain, titrations between NusA ar2 and SKK domain have been performed. Upon NusA ar2 binding, notable chemical shift changes were observed in the KH1 region of SKK domain. The residues which were affected on binding to NusA ar2 were also affected during the SKK and lambda nutL titration experiments. The results are in good agreement with the proposed idea that NusA ar2 possibly occludes the RNA binding domains of NusA. To investigate the effect of alpha-CTD on RNA binding by NusA, titration of the complex containing SKK domain and NusA ar2 by gradually adding an increased molar ratio of alpha-CTD have been carried out. On addition of alpha-CTD, it was clearly observed that alpha-CTD displaced NusA ar2 from the complex suggesting that the inhibition of RNA binding by NusA ar2 could be released by alpha-CTD.show moreshow less
Im Phagen lambda wird die Antitermination durch das lambda-codierte N Protein initiiert, das eine Vielzahl von Wirtsproteinen, die sogenannten Nus Faktoren, rekrutiert. Bisher sind nur einige von diesen Wirtsproteinen, die für eine effiziente Termination und Antitermination der Transkription wichtig sind, identifiziert. Dazu gehören NusA, NusB, NusE und NusG. Gegenstand dieser Arbeit war die Charakterisierung von möglichen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Nus Wirtsfaktoren im TerminatIm Phagen lambda wird die Antitermination durch das lambda-codierte N Protein initiiert, das eine Vielzahl von Wirtsproteinen, die sogenannten Nus Faktoren, rekrutiert. Bisher sind nur einige von diesen Wirtsproteinen, die für eine effiziente Termination und Antitermination der Transkription wichtig sind, identifiziert. Dazu gehören NusA, NusB, NusE und NusG. Gegenstand dieser Arbeit war die Charakterisierung von möglichen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Nus Wirtsfaktoren im Terminations- und Antiterminations system mit Hilfe von NMR Spektroskopie. Ebenso wie das N Protein benötigt auch Nun zusätzliche Wirtsfaktoren für eine funktionierende Termination. Bisher wurde nur gefunden, dass NusA mit der C-terminalen Region von Nun interagiert, wobei für die Bindung von Nun an NusA die NusA ar1 Region benötigt wird. Darauf aufbauend wurde mit Hilfe von 1H,15N-HSQC Spektren die Wechselwirkung zwischen HK022-Nun und NusA ar1 untersucht. Dabei konnten keinerlei Veränderungen der chemischen Verschiebung während der Titration beobachtet werden. Folglich findet keine Interaktion zwischen NusA ar1 und Nun statt. Über die Wechselwirkung zwischen Nun und NusG oder NusB gibt es bis jetzt noch keine Informationen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Titrationsstudien mit Nun und diesen beiden Nus Faktoren zeigten ebenso keine direkten Interaktionen. Basierend auf den durchgeführten Experimente kann gefolgert werden, dass keine direkten Wechselwirkungen zwischen Nun und NusA ar1, NusG oder NusB vorhanden sind. Der Transkriptions-Elongationsfaktor NusA, der die nut RNA bindet, enthält Bereiche, die zu der Klasse der S1 und KH homologen Domänen gehören und als RNA Bindungsdomänen identifiziert wurden. Um einen detaillierten Einblick in die Bindungsfläche der SKK Domänen bei der Bindung an die nut RNA zu bekommen, erfolgte eine sequenzspezifische Zuordnung der Amidresonanzen des Proteinrückgrats. Die fast vollständige Zuordnung (80,5%) ermöglichte nun die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen der SKK Domäne und der nut RNA mit Hilfe von NMR Spektroskopie. Bei der Titration der SKK Domäne mit der unmarkierten lambda nutL RNA konnten deutliche Veränderungen der chemischen Verschiebung beobachtet werden, die auf eine direkte Interaktion schließen lassen. Eine Visualisierung der Veränderungen der chemischen Verschiebung auf der Oberfläche von NusA SKK zeigt, dass die RNA Bindungsfläche hauptsächlich im Bereich der beiden KH Domänen zu finden ist. Dies deutet somit auf eine sequenzspezifische RNA Bindung hin. NusA kann im freien zustand keine RNA binden. Erst durch die Bindung an die alpha-CTD der RNA polymerase wird diese Selbstblockade aufgehoben. Da Experimente auf eine Interaktion zwischen der alpha-CTD und NusA ar2 hindeuteten, könnte möglicherweise NusA ar2 die RNA Bindungsstelle blockieren. Um diesen autoinhibitorischen Effekt zu untersuchen, wurde NusA ar2 zu der SKK Domäne titriert. Dabei konnte für diejenigen Aminosäuren eine Veränderung der chemischen Verschiebung beobachtet werden, die auch an der Bindung der RNA beteiligt sind, so dass hierdurch die Hypothese der Selbstblockade durch NusA ar2 bestätigt werden konnte. Eine Titration des Komplexes aus NusA ar2 und der SKK Domäne mit alpha-CTD zeigte, dass durch die Zugabe von alpha-CTD NusA ar2 von der RNA Bindungsstelle verdrängt wird und bestätigt damit ebenso die autoinhibitorische Rolle von NusA ar2.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Sujatha Pagadala Santhanam
Advisor:Prof. Dr. Paul Rösch
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:22.10.2008
Year of Completion:2008
SWD-Keyword:Antitermination; Bakteriophage Lambda; Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie; Protein-Protein-Wechselwirkung; Transkription
Tag:Alpha- Untereinheit; HK022-Nun; NMR spektroskopie; NusA; RNA-polymerase
Alpha-Subunit; HK022-Nun; NMR spectroscopy; NusA; RNA-polymerase
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
RVK - Regensburg Classification:WC 4170
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-4826
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):11.11.2008