Chemische Modifikation von siRNAs zur Verbesserung der zellulären Aufnahme

Chemical Modification of siRNAs for enhanced Cellular Uptake

Um therapeutisch wirksam zu sein, muss eine siRNA die Zellmembran überwinden und ins Zytoplasma gelangen. Auf Grund der negativen Ladung unmodifizierter Nukleinsäuren und des hohen Molekulargewichts ist eine passive Permeation ins Zytoplasma unwahrscheinlich. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, durch die Anknüpfung kleiner Moleküle an den 5´-Terminus des Sense Strangs einer siRNA deren Aufnahme ins Zytoplasma zu erreichen. Hierzu wurden verschiedene siRNA-Konjugate synthetisiert, welche in einUm therapeutisch wirksam zu sein, muss eine siRNA die Zellmembran überwinden und ins Zytoplasma gelangen. Auf Grund der negativen Ladung unmodifizierter Nukleinsäuren und des hohen Molekulargewichts ist eine passive Permeation ins Zytoplasma unwahrscheinlich. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, durch die Anknüpfung kleiner Moleküle an den 5´-Terminus des Sense Strangs einer siRNA deren Aufnahme ins Zytoplasma zu erreichen. Hierzu wurden verschiedene siRNA-Konjugate synthetisiert, welche in einem in vitro Modellsystem ohne Verwendung eines Transfektionsreagenzes die posttranskriptionelle Hemmung der apoB Genexpression in Leberparenchymzellen ermöglichen. Ein erster Ansatz zielte auf die Erhöhung der Hydrophobizität der siRNAs und eine damit verbundene Erleichterung der zellulären Annäherung. Als Grundbausteine dienten Lithocholsäure, Cholesterin, Betulin und 3-Beta-Cholestanol. Durch kurze organisch chemische Synthesesequenzen wurden diese Verbindungen in das entsprechende Phosphoramidit überführt, um eine Kopplung während der RNA-Festphasensynthese zu ermöglichen. Unter Verwendung verschiedener Linker konnte das Spektrum der Modifikationen erweitert werden. Des Weiteren wurde versucht, durch Amidbindungsknüpfung zwischen einer NHS-Ester aktivierten siRNA und verschiedenen Aminen, kationischen Aminosäuren und Dipeptiden, die Lipophilie der siRNA zu erhöhen. So sollte eine Aufnahme über Zellpenetration, bestimmte Aminosäurekanäle oder Nährstofftransporter erreicht werden. In einem weiteren Ansatz wurde eine definierte Rezeptor-vermittelte Aufnahme nach Glykokonjugation der siRNA mit linearen und verzweigten Galaktose-Strukturen zur Überwindung der Zellmembran angestrebt. Hierzu wurde beta-D-Galaktosepentaacetat in ein Phosphoramidit umgewandelt und während der RNA-Festphasensynthese verschiedene siRNA-Konjugate synthetisiert. Zunächst wurden die Eigenschaften der modifizierten siRNAs untersucht. Anhand von Transfektionsexperimenten wurde deren Aktivität im Hinblick auf die posttranskriptionelle Hemmung der apoB Genexpression gezeigt. Mit Hilfe eines Membranintegritätstests konnten keine zytotoxischen Eigenschaften für die verwendeten Zelllinien detektiert werden. Der Fokus der folgenden Dosis-Wirkungs-Experimente richtete sich auf die Galaktose-konjugierten Nukleinsäuren. Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung konnte sowohl in An- als auch in Abwesenheit eines Transfektionsreagenzes für das SBGAL- und SBTEGGAL-Konjugat nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Glykokonjugation von verzweigten Galaktose-Strukturen an siRNAs konnte in dieser Arbeit erstmals eine definierte Rezeptor-vermittelte Aufnahme über den Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR) gezeigt werden. Infolge dessen war eine posttranskriptionelle Hemmung der apoB Genexpression in humanen Leberkarzinomzellen möglich. Durch Stimulation dieses Rezeptors mit Kalziumchlorid konnten die beobachteten RNA-Interferenz-Effekte erheblich gesteigert werden. Die SBGAL-modifizierte siRNA bewirkte in einer Konzentration von 10 µM eine 70%ige Reduktion der apoB m-RNA, während mit dem SBTEGGAL-Konjugat eine Abnahme des m-RNA Gehalts um 90% gezeigt werden konnte. Anhand fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen Cy3-markierter SBGAL- und SBTEGGAL-Konjugate wurde eine Internalisierung dieser siRNAs ins Zytoplasma deutlich gemacht, wobei durch Aktivierung des Rezeptors eine vermehrte Aufnahme der siRNAs ins Zytoplasma zu beobachten war. In den durchgeführten Kompetitionsstudien wurde durch Zusatz des stärker an den Rezeptor bindenden Liganden N-Acetylgalaktosamin eine Internalisierung der siRNAs verhindert und es konnten keine RNA-Interferenz-Effekte mehr detektiert werden. Alle Experimente zur Dosis-Wirkung, Rezeptorstimulation sowie die Kompetitionsstudien wurden mit vergleichbaren Ergebnissen in einer Rattenleberkarzinomzelllinie bestätigt. Diese Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung von RNAi-basierenden Therapeutika und eröffnen neue Möglichkeiten für die gezielte Ablieferung von siRNAs in Leberparenchymzellen bei kommenden in vivo Experimenten.show moreshow less
Therapeutic application of siRNAs requires delivery to the correct intracellular compartment. Due to their negative charge und high molecular weight, unmodified nucleic acids are unable to cross cellular membranes. The aim of this work was to achieve uptake of siRNAs into the cytoplasm of target cells without the use of transfection reagents, by coupling small molecules to the 5´-end of the sense strand of the siRNA. As a result of enhanced membrane permeation, these conjugates should be capableTherapeutic application of siRNAs requires delivery to the correct intracellular compartment. Due to their negative charge und high molecular weight, unmodified nucleic acids are unable to cross cellular membranes. The aim of this work was to achieve uptake of siRNAs into the cytoplasm of target cells without the use of transfection reagents, by coupling small molecules to the 5´-end of the sense strand of the siRNA. As a result of enhanced membrane permeation, these conjugates should be capable of causing posttranscriptional silencing in the absence of transfection reagents. Parenchymal liver cells constitutionally expressing the apoB gene were used as a model system, und the ability of modified siRNAs to silence apoB gene expression in these cells were analyzed. A first approach aimed at the formation of hydrophobic siRNA conjugates to alleviate cellular association und improve cytoplasmic delivery. To this end, lithocholic acid, cholesterol, betulin und 3-beta-cholestanol were chemically modified to yield the corresponding phosphoramidites that were directly used as coupling agent in RNA solid phase synthesis. A variety of different linkage structures broadened the chemical space probed by this investigation. Alternatively, several amines, cationic amino acids und dipeptides were coupled via amide bond formation to siRNAs activated by NHS linkages. Using this approach, the goal was to increase the lipophilicity of the siRNA und to permit uptake via cell penetration or amino acid und nutrient transport systems. Finally, it was undertaken to generate uptake via receptor-mediated processes. Glycoconjugation of siRNAs with linear und branched structures comprising galactose was selected to target the asialoglycoprotein receptor. A phosphoramidite was generated from beta-D-Galactosepentaacetate und different siRNA conjugates were synthesized by solid phase synthesis. The ability of the above described conjugates to mediate posttranscriptional silencing of the apoB gene expression was demonstrated by classic transfection experiments. Cytotoxic effects, which could potentially interpreted as false positives, were rouled out by means of a membrane integrity assay. The subsequent dose-response experiments focused on the galactose-modified siRNAs. Ultimately, a dose-dependent reduction of the apoB protein und mRNA content could be demonstrated in the presence or absense of a transfection reagent. The results presented herein show for the first time a receptor-mediated uptake via the asialoglycoprotein receptor as a consequence of glycoconjugation of siRNAs with branched galactose structures. Thereby, posttranscriptional silencing of the apoB gene expression was achieved in parenchymal human liver cells. Stimulation of this receptor with calcium chloride significantly increased siRNA activity. A SBGAL-conjugated siRNA decreased apoB mRNA by about 70% at a concentration of 10 µM. At the same concentration a SBTEGGAL-conjugated siRNA reduced mRNA content by about 90%. Localisation of the siRNA to the cytoplasm was demonstrated by fluorescence microscopy. Calcium-dependent receptor activation enhanced intracellular fluorescence. The uptake of siRNAs und the mRNA reduction could competed out by an excess of N-acetylgalactosamine, the latter having a 40-fold higher binding affinity for the receptor compared to galactose. The above described experiments were repeated und results confirmed using a rat hepatocyte cell line. These results represent a significant advancement of RNAi-based therapeutics und establish a new strategy for the delivery of siRNAs to parenchymal liver cells in vivo.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Andrea Forst
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Krauss
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:27.03.2007
Year of Completion:2006
SWD-Keyword:Apolipoprotein B; Modifizierung; RNS-Interferenz; Zellkultur
Tag:Glykokonjugation; Nukleinsäure; Therapeutika; siRNA
RNA-Interference; delivery; glycoconjugation; siRNA; therapeutics
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
RVK - Regensburg Classification:VS 5000
RVK - Regensburg Classification:VW 5050
RVK - Regensburg Classification:VW 9907
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-2846
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):10.05.2007