Regulation der Transkription: Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen der carboxyterminalen Domäne von E.coli NusA

Regulation of Transcription: structure, dynamics, and interactions of the carboxy-terminal domain of E.coli NusA

Die RNA-Synthese in der Zelle wird durch RNA Polymerasen (RNAPs) katalysiert und erfolgt in einem Zyklus aus Initiation, Elongation und Termination. In den letzten Jahren konnten durch die Aufklärung von Kristallstrukturen elongierender RNAPs vor allem Fortschritte im Verständnis der Elongationsphase erzielt werden, so daß die Elongation derzeit ein attraktives Forschungsgebiet darstellt. Während der Elongation bildet die RNAP einen stabilen Komplex mit DNA und RNA, der als TranskriptionselongatDie RNA-Synthese in der Zelle wird durch RNA Polymerasen (RNAPs) katalysiert und erfolgt in einem Zyklus aus Initiation, Elongation und Termination. In den letzten Jahren konnten durch die Aufklärung von Kristallstrukturen elongierender RNAPs vor allem Fortschritte im Verständnis der Elongationsphase erzielt werden, so daß die Elongation derzeit ein attraktives Forschungsgebiet darstellt. Während der Elongation bildet die RNAP einen stabilen Komplex mit DNA und RNA, der als Transkriptionselongationskomplex (TEC) bezeichnet wird, und über Tausende von Basenpaaren prozessiv ist, das heißt nicht dissoziiert. Lediglich an bestimmten DNA-Elementen, sogenannten Terminatoren, kann der TEC soweit destabilisiert werden, daß die Transkription beendet werden kann. Die Effizienz der Termination wird dabei durch Transkriptionsfaktoren reguliert. In E.coli wird die Entscheidung Elongation-versus-Termination an einem Terminator durch den allgemeinen Transkriptionsfaktor NusA beeinflußt. NusA assoziiert während der Elongation mit dem TEC und fördert sowohl Pausen während der Transkription als auch die Termination. Dagegen wirkt NusA zusammen mit dem viralen Antiterminator-Protein lambda N selbst als Antiterminator und setzt die Terminationseffizienz herab. Sequenzvergleiche zwischen verschiedenen bakteriellen NusA-Proteinen sowie biochemische Daten weisen darauf hin, daß NusA aus drei funktionellen Domänen besteht. Dabei wechselwirkt die aminoterminale Domäne mit den großen Untereinheiten der RNAP während die zentrale Domäne RNA-Interaktionen vermittelt. Die ungefähr 160 Aminosäuren umfassende carboxyterminale Domäne, NusACTD, ist nur in einigen NusA-Proteinen vorhanden. NusACTD ist auffallend negativ geladen und enthält eine Sequenzwiederholung. Für den konservierten aminoterminalen und zentralen Bereich von NusA wurden die Strukturen von T.maritima und M.tuberculosis mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Eine hochaufgelöste Struktur für NusACTD konnte dagegen erst in dieser Arbeit mit NMR-Spektroskopie gewonnen werden. NusACTD besteht aus zwei strukturell ähnlichen Domänen NusA(353-416) (AR1)und NusA(431-490) (AR2), die ungefähr den zwei homologen sauren Sequenzbereichen entsprechen. Mit 15N-Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, daß die Domänen über eine flexible Linkerregion verbunden sind und keine definierte Orientierung zueinander einnehmen. Jede der Domänen weist fünf Helices auf, die eine (HhH)2-Faltung annehmen. Charakteristisch für die (HhH)2-Faltung sind jeweils zwei gegeneinander gepackte HhH-Motive, die zusammen mit der Verbindungshelix zwischen den Motiven einen kompakten hydrophoben Kern bilden. (HhH)2-Faltungen kommen häufig als selbständige Domänen vor, die DNA-Protein- und Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln. E.coli NusACTD wechselwirkt mit dem viralen lambda N-Protein sowie der carboxyterminalen Domäne der alpha Untereinheit der RNAP (alpha CTD). Zudem reguliert NusACTD die RNA-Bindung an die zentrale Domäne von NusA, indem es selbst mit den RNA-Bindungsstellen interagiert. Trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeit erkennen AR1 und AR2 lambda N und alpha CTD auf unterschiedliche Art und Weise. In dieser Arbeit durchgeführte Titrationsexperimente weisen darauf hin, daß alpha CTD ausschließlich an AR2 bindet, während lambda N wahrscheinlich nur mit AR1 spezifische Kontakte ausbildet. Die Wechselwirkung von alpha CTD mit NusA ermöglicht in vitro eine RNA-Bindung an NusA. Es ist daher anzunehmen, daß AR2 eine autoinhibitorische Funktion besitzt. Zusätzlich scheinen die Wechselwirkungen von NusACTD und alpha CTD zur Stabilisierung der RNAP-NusA-Interaktion beizutragen. Die antiterminatorische Wirkung von lambda N beruht auf einer direkten Interaktion zwischen der RNAP und einer Region von lambda N außerhalb der NusA-Bindungsregion. Die lambda N-NusA-Wechselwirkung steigert die Antiterminationseffizienz von NusA wahrscheinlich über eine Stabilisierung der schwachen RNAP-lambda N-Interaktion. Der Vergleich der Struktur von AR1 im ungebundenen Zustand mit der kürzlich gelösten Röntgenkristallstruktur des NusA(350-424)-lambda N(34-47)-Komplexes unterstützt die Hypothese, daß die NusA-lambda N-Wechselwirkung nicht direkt am Mechanismus der Antitermination beteiligt ist, da nur geringe konformationelle Änderungen durch die Komplexbildung beobachtet werden. Insgesamt stellt NusACTD über seine beiden (HhH)2-Module eine vielseitige Interaktionsfläche bereit, die möglicherweise Bindungsstellen für weitere Proteine neben alpha CTD und lambda N bietet. Die Trennung der Domänen über eine mobile Linkerregion ermöglicht eine Anpassung an konformationelle Veränderungen in der TEC-Struktur, die zum Beispiel beim Übergang des TEC von einem Elongations- in einen Antiterminationszustand auftreten können. Die flexible Verbindung zwischen den Domänen ist zudem für den Mechanismus der Autoinhibition wichtig, da bei der Bindung von NusA an den TEC die RNA Zugang zu den Bindungsstellen erhält.show moreshow less
RNA synthesis in cells is catalyzed by RNA polymerases (RNAPs) in a three-step process divided in an initiation, elongation, and termination phase. Recent research has mainly focused on transcription elongation as new incentives were provided by high resolution X-ray structures of elongating RNAPs. Transcribing RNAPs form an extremly stable yet conformationally flexible complex called transcription elongation complex (TEC)containing the DNA template, the RNA transcript, and the RNAP. Only at speRNA synthesis in cells is catalyzed by RNA polymerases (RNAPs) in a three-step process divided in an initiation, elongation, and termination phase. Recent research has mainly focused on transcription elongation as new incentives were provided by high resolution X-ray structures of elongating RNAPs. Transcribing RNAPs form an extremly stable yet conformationally flexible complex called transcription elongation complex (TEC)containing the DNA template, the RNA transcript, and the RNAP. Only at special template sites, called terminators, the TEC is destablized such that it may dissociate. The efficiency of termination is highly regulated by transcription factors. In E.coli the elongation/termination decision is considerably influenced by the general transcription factor NusA which associates tightly with the TEC. Generally NusA enhances transcription pausing and termination, but for example in the presence of the bacteriophage lambda N antiterminator protein it also stimulates antitermination. Sequence comparisons among NusA proteins of different bacterial species show a common domain organisation, harboring an amino-terminal RNAP binding domain, a central RNA binding domain, and an approximately 160 amino acid carboxy-terminal domain, NusACTD, which is only present in some species. NusACTD is characterized by its acidity and often by an internal sequence repeat of approximately 70 residues. While the structure of the conserved amino-terminal and RNA-binding domains is known from X-ray studies of homologous T.maritima and M.tuberculosis NusA, a structural basis for E.coli NusACTD could only be established in this work using NMR spectroscopy. The solution structure of NusACTD shows two structurally similar subdomains NusA(353-416) (AR1) and NusA(431-490) (AR2), matching roughly the two homologous acidic sequence repeats. 15N relaxation data indicate that the domains are connected by a flexible linker region and do not interact. Both domains feature five helices which adopt a (HhH)2 fold. (HhH)2 folds consist of two HhH-motifs linked together by a so-called connector helix. Together, the helices of the HhH-motifs and the connector helix form a tight hydrophobic core. Commonly (HhH)2 folds occur as independent domains mediating DNA-protein and protein-protein interactions. In E.coli NusACTD interacts with the protein N of bacteriophage lambda and the carboxy-terminus of the alpha subunit of the E.coli RNAP (alpha CTD). Furthermore NusACTD has been implicated in the regulation of RNA binding to the central domain of NusA. Despite their similarity, NusA(353-416) and NusA(431-490) recognize alpha CTD and lambda N differently. This could be shown in NMR titration experiments performed in this work. alpha CTD interacts only with AR2, whereas lambda N probably restricts its specific interactions to AR1. Since alpha CTD can relieve the inhibitory effect of NusACTD in vitro these data indicate that AR2 functions as an autoinhibitory domain. Additionally, the interactions of NusACTD with alpha CTD may serve to increase the stability of the NusA-RNAP interaction. Though the antitermination effect of lambda N is due to a direct lambda N-RNAP interaction, which is exerted by parts of lambda N other than the NusA binding region, the binding of lambda N to NusA could stabilize the weak RNAP-lambda N interaction and thus render antitermination efficient. Comparison of the free AR1 structure with the recently solved X-ray structure of the NusA(350-424)-lambda N complex supports the idea that the NusA-N interaction is not involved in the antitermination mechanism per se as only minor conformational rearrangements are observed upon complex formation. In summary, the structure of the carboxy-terminal domain suggests how NusACTD fulfills its role as a versatile interaction site, probably serving as a platform for binding partners beyond alpha CTD and lambda N. The separation of the domains via the mobile linker could provide a means to adjust to changes in TEC structure upon transition from the elongation to the antitermination state. Furthermore the flexible linker is crucial for the rearrangement of AR2 upon binding to the elongation complex to render access to the RNA binding sites of NusA.show moreshow less

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Metadaten
Institutes:Chemie
Author: Anke Eisenmann
Advisor:Prof. Dr. Paul Rösch
Granting Institution:Universität Bayreuth,Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Date of final exam:26.08.2005
Year of Completion:2005
SWD-Keyword:Genregulation; NMR-Spektroskopie; Strukturaufklärung; Transkription <Genetik>
Tag:NusA (N utilization substance)
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
RVK - Regensburg Classification:WC 4170
URN:urn:nbn:de:bvb:703-opus-1820
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):29.09.2005